血吸虫毛蚴孵化实验最佳观察时间的探讨

周明莉 王雪峰

目前我国血防工作取得了举世瞩目的成绩，大部分血吸虫病流行区已经被消灭或控制，但形势依然严峻。目前我国许多血吸虫病流行地区处于低度传播或低度流行状态[1]，本地区的血吸虫病已于2013年达到了传播控制标准[2]，采取了一系列防治与监测措施[3-4]，使人群血吸虫感染率近两年维持在1%以下[5]。各地基层防控队伍的工作重心逐步转向预防控制血吸虫病[6]。因此对现有诊断方法的改进或新诊断方法的研发提出了新的需求，对防治新技术、新产品、新方法的需求越来越大，亟需建立高水平的防治专业队伍、培养高素质的专业技术人员，来承担和推进我国血吸虫防治工作[7-9]。病原学检测方法为确诊血吸虫病的重要依据,许多感染者体内的虫荷及虫体分泌排泄物的数量较少甚至极少，导致包括尼龙绢集卵孵化法在内的经典病原学诊断方法的敏感性显著降低、漏诊率大幅度升高，从而无法对这些地区的血吸虫病患者进行有效的诊断。本研究通过一系列毛蚴孵化实验总结出毛蚴结果观察的最佳观察时间，从而有效提高病原学阳性检出率，特别是对于易漏检的低虫卵量样本，以便为临床提供更准确的实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 阴性和阳性样本 将血吸虫感染钉螺按常规逸出血吸虫尾蚴，感染家兔后饲养45 天，取出兔肝虫卵彻底粉碎后计数、备用。用来自非疫区健康牛粪作为阴性样本；用定量加入法在非疫区健康牛粪中加入新鲜血吸虫卵，混匀后作为血吸虫阳性样本。

1.1.2 实验分组 阴性对照组40份，每份为30 g非疫区的健康牛粪；低含量实验组40份，每30 g非疫区的健康牛粪中加入20个虫卵；高含量实验组40份，每30 g健康牛粪中加入100个虫卵。

1.1.3 相关设备 光学显微镜、光照培养箱、低速离心机、尼龙绢袋、移液器、LED光源、凸透镜、孵化瓶等。

1.2 方法

1.2.1 血吸虫毛蚴孵化实验 严格按原卫生部发布的《血吸虫病诊断标准（WS 261-2006）》附录C中规定的方法进行，将三组实验样本经反复淘洗、沉淀、将粪渣移入孵化瓶，加孵化用水至瓶颈处，置于25 ℃光照培养箱中孵化，在黑色背景下分别于1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、8 h各观察1次结果，每次观察至少5分钟，每次均由第二人复核。一次不能完成全部实验时，可以按计划分数天完成，但每次的实验条件、实验温度、实验器具、实验人员等均应保持一致。

1.2.2 阳性确认方法 为保证阳性实验结果的准确可靠，当上述实验组血吸虫尼龙绢袋毛蚴孵化实验判定为阳性时，均按阳性确认方法进行确认，具体操作为：从孵化瓶口近1 cm处吸取孵化液5 mL装入玻璃试管中，按5%的比例即加入250 µL甲醛溶液，将毛蚴固定，使用低速离心机以3 000 r/min离心10分钟，倒去上清液，留沉渣，加入碘酊1～2滴，充分混匀，使得毛蚴着色，用吸管吸出全部沉渣液体于载玻片上，在显微镜下观察若发现毛蚴，即可确定此份样本为血吸虫虫卵孵化实验阳性。

1.2.3 阳性定量方法 当上述实验中显微镜下发现毛蚴时，应将此份样本进行毛蚴定量，注意将所有沉渣涂于载玻片上时，应占载玻片面积的2/3，不易过厚，以免毛蚴堆积。在显微镜下观察整张载玻片上的毛蚴数，并分别记录下1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、8 h各时间点的毛蚴总数。计算每实验组40份样本分别在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、8 h各时间点毛蚴的平均数。

1.3 统计学处理

采用Microsoft Excel 2007建立数据库，利用SPSS 20.0软件对上述数据进行数据处理，计量资料以（均数±标准差）表示，对于计数资料，采用%进行一般描述。

2 结果

2.1 阴性对照组样本的孵化结果

阴性对照组血吸虫毛蚴孵化实验结果均为阴性，无一例假阳性结果出现，阴性符合率为100%。另外结果的判断按照阳性确认方法进行确认，均为阴性结果。

2.2 阳性对照组样本的孵化结果

通过阳性确认方法和阳性定量方法，在显微镜下计数整张载玻片上的毛蚴数，将每组阳性实验组样本孵出毛蚴的平均数作为此组实验组孵出的毛蚴数，分别记录两组阳性实验组样本在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、8 h的毛蚴孵出数并计算毛蚴孵出率（孵出毛蚴数占相应实验组毛蚴总数的百分率）具体结果见下表1。

实验显示，低含量实验组和高含量实验组在1 h、2 h、3 h时毛蚴孵出数量均相对较多，8 h后低含量实验组孵出数量极低，高含量实验组孵出数量也急剧下降。

表1 3个实验组在6个时间点毛蚴孵化结果分析（±s）

表1 3个实验组在6个时间点毛蚴孵化结果分析（±s）

平均孵出毛蚴数（个）及孵出率1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 8 h阴性对照组 0 0 0 0 0 0 0低含量实验组 20 3.3±0.2（16.5%） 3.8±0.3（19.0%） 4.5±0.5（22.5%） 2.1±0.3（10.5%） 1.3±0.2（6.5%） 0.1±0.1（0.5%）高含量实验组 100 18.7±0.5（18.7%） 21.8±0.6（21.8%） 19.8±0.6（19.8%） 9.5±0.4（9.5%） 8.9±0.3（8.9%） 1.3±0.2（1.3%）合计 120 22.0±0.4（18.3%） 25.6±0.7（21.3%） 24.3±0.6（20.3%） 11.6±0.5（9.7%） 10.2±0.5（8.5%） 1.4±0.2（1.2%）总毛蚴数（个）组别

3 讨论

血吸虫病的早期诊断可以确定人群感染率、感染度、传播变化等，对血吸虫病的防治尤为重要，还是考核防治效果以制定防治策略的主要工具。

血吸虫病的实验诊断可分三大类，即病原学诊断、免疫学诊断和核酸诊断。

病原学诊断为血吸虫病的确诊实验，其最初采用的是直接涂片法，后来发展了多种血吸虫虫卵的检查方法，但相对阳性率较低，其特异性高但灵敏度低，特别对于一些低感染个体中的病原体很难检出。尤其是样本中毛蚴数量较少和长时间观察的情况下，漏检和误判的比例更高[10]，影响工作效率和结果的准确性[11]。因此，对目前诊断方法的可靠性、阳性率也提出了新的挑战。随着疾病诊疗的机械化、智能化，众多的自动化医疗器械广泛应用于疾病诊断，如全自动生化分析仪、手术机器人等[12-13]。但血吸虫病的病原学诊断尚处于“手工操作”阶段[14]，检测手段和方法亟待改善。

本研究的阴性对照组中，尼龙绢集卵孵化实验均未出现假阳性现象，其原因与孵化用水的质量和对实验用具严格消毒杀卵、杜绝交叉污染有关。以往有些实验中的孵化用水为河水或井水，水中可能含有原生动物，或者脱氯水因放置时间过久，水中混杂其他微生物和离子，导致假性实验结果或干扰结果判定，从而得出假阳性结果。本研究中所用的孵化水为自来水先加热至沸腾后，冷却至室温所得，可以避免水中原生动物对实验结果观察的干扰。

本研究为提高尼龙绢集卵毛蚴孵化实验的阳性率，总结出实验中观察毛蚴结果的最佳时间。在低含量实验组中1 h、2 h、3 h时毛蚴孵出率分别为16.5%、19.0%、22.5%，高含量实验组中1 h、2 h、3 h时毛蚴孵出率分别为18.3%、21.3%、20.3%，在4 h后毛蚴孵出率均下降，8 h后孵出数量率极低。在两种不同含量虫卵实验组中各时间点的孵出率情况一致，无显著差异。因此，正确把握最佳观察时间点，着重观察，适当延长重要观察点1 h、2 h、3 h的观察时间，可以提高尼龙绢集卵毛蚴孵化实验的阳性率，特别是对于低含量样本，能为临床提供更准确的实验室诊断。以便使我省能尽早达到血吸虫病传播阻断的标准，从而尽早实现控制和消灭血吸虫病，减少血吸虫对人民的严重危害。