两亲性壳聚糖/槲皮素纳米胶束的制备及其理化性质研究

王慧 杨子明 何祖宇 周闯 王超 李普旺

摘  要  槲皮素（QCT）是一种类黄酮化合物，具有较强的抗氧化、抗炎等作用，在热带植物界中广泛存在。但由于槲皮素溶解度低、稳定性差，因此限制了其在食品、医药中的应用。本研究以脱氧胆酸（DA）为疏水基团，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）作为亲水基团合成了一种新型两亲性壳聚糖（ACS），并制备了两亲性壳聚糖槲皮素纳米胶束（ACS-QNMs）。结果表明，傅里叶红外光谱分析证明DA和NAC已成功接枝到壳聚糖上，荧光分光光度计测定空白胶束的临界胶束浓度值（CMC）为26.92 μg/mL，扫描电镜观察纳米载药胶束外观呈球形且分布均匀。纳米粒度电位分析仪测定纳米胶束电位为31 mV。研究表明，槲皮素经两性壳聚糖包埋后，能在人体温度37 ℃下缓慢释放，同时在室温下稳定储存。

关键词  两亲性壳聚糖;槲皮素;纳米胶束;荧光分光光度计

中图分类号  R318.08      文献标识码  A

Abstract  Quercetin （QCT） is a flavonoid compound with strong antioxidant and anti-inflammatory effects， which is widely found in tropical plants. However， the low solubility and poor stability of quercetin limit its application in food and medicine. In this study， a novel amphiphilic chitosan （ACS） with deoxycholic acid （DA） as the hydrophobic group and n-acetyl-l-cysteine （NAC） as the hydrophilic group was synthesized， and the amphiphilic chitosan quercetin nanoparticle micelle （ACS-QNMs） was prepared and characterized. FTIR showed that DA and NAC were grafted onto chitosan successfully. The critical micelle concentration （CMC） of blank micelles was 26.92 μg/mL. Scanning electron microscopy （SEM） was used to observe the spherical appearance and uniform distribution of nanoparticles. The micelle potential was determined by nano particle size potentiometer to be 31 mV. The results showed that quercetin could be released in vivo and stored stably at room temperature after being embedded in nanomicelles.

Keywords  amphiphilic chitosan; quercetin; nanomicelles; fluorescence spectrophotometer

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.021

槲皮素是一種多羟基类黄酮化合物，在亚热带植物体内广泛存在，具有抗氧化、降血压、降血脂、抗炎等多种生物学活性[1]。但由于槲皮素为平面型分子，分子间引力较大，且不容易被溶剂或溶质分散，因此其水溶解度低，化学稳定性差，很大程度上限制了槲皮素作为功能成分在食品和医药中的应用[2]。纳米微胶囊化技术具有药物保护作用，能避免芯材受到外界不良环境的影响，并具有靶向递送和控制释放等特点，受到广泛关注[3-4]。采用纳米微胶囊技术提高类似槲皮素的植物源天然产物的生物利用率以提升其经济价值是目前一大研究热点。Aluani等[5]以壳聚糖/海藻酸钠为壁材包埋槲皮素，并对其进行安全性以及性能评价，研究表明，经包埋后槲皮素抗氧化活性增强，槲皮素纳米粒子在体外无显著细胞毒性，口服空载纳米粒子以及槲皮素纳米粒子都不会引起大鼠肝脏生化参数的变化。Wang等[6]通过薄膜水合和真空冷冻干燥技术将槲皮素包封在聚合物胶束中，提高槲皮素的水溶性和稳定性，结果表明，冻干纳米胶束粒径范围20～80 nm，在Caco-2细胞上展示出低细胞毒性，但对C6神经胶质瘤细胞具有显著细胞毒性;体内试验表明，槲皮素纳米胶束有益于携带神经胶质瘤小鼠的存活。因此，纳米微胶囊化技术能增强药物溶解行并持续释放，是一种极具应用前景的递送方法。

壳聚糖是自然界中唯一碱性多糖，生物相容性好，对生物体无毒且可降解[7-8]。由于其是刚性直链分子，溶解度低，可通过引入一些官能团对其进行修饰，制备功能性的两亲性壳聚糖是目前一大研究热点[9]。具有疏水链与亲水链的两亲性壳聚糖作为疏水药物载体，在水中的自组装形成胶束也引起了广泛的关注[10-11]。壳聚糖的疏水端与药物接触形成疏水内核，亲水链与外部水相接触形成稳定的核壳结构。两亲性壳聚糖作为壁材能有效的提高药物的溶解度和生物利用率，并降低毒副作用。Sukamporn等[12]通过两亲性壳聚糖形成自组装胶束，其临界胶束值为37.2 μg/mL。载有虎刺醛的纳米胶束呈球形，且平均粒径约200 nm。细胞毒性研究表明该递送体系具有较高递送效率且安全可靠，可作为如虎刺醛等疏水性化合物的载体。

本研究通过将脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸分别接枝到壳聚糖氨基上合成两亲性壳聚糖，并通过傅里叶红外光谱对其进行表征。通过超声自组装法包封槲皮素制备槲皮素纳米胶束，并对纳米胶束进行物理与化学表征。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  壳聚糖（CS，黏度<200 mPa?s，脱乙酰度97.8%）以及N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）都采购于中国Aladdin公司。槲皮素（QUE，含量≥95%）采购于美国Sigma试剂公司。脱氧胆酸（DA）采购于日本化成工业株式会社。1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），1-羟基-苯并三唑（Hobt）和5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）都采购于中国Aladdin公司。

1.1.2  仪器与设备  UV1700型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司;FTS3000型傅里叶红外光谱仪，美国伯乐公司;F7000型荧光分光光度计，日本日立公司;Zetasizer Nano ZS纳米粒度及Zeta电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司;集热式恒温加热磁力搅拌器，杭州大力科教仪器有限公司;真空冷冻干燥机，德国Christ公司。

1.2  方法

1.2.1  脫氧胆酸接枝壳聚糖的合成  按文献[13-15]中的方法并加以改进，采用乙二胺为催化剂使脱氧胆酸与壳聚糖胺基反应，生成脱氧胆酸改性壳聚糖（CS-DA）。将1 g壳聚糖溶解在40 mL 1%乙酸溶液中，再用40 mL无水乙醇稀释。将一定量脱氧胆酸溶解在乙醇中再加入乙二胺以活化脱氧胆酸的羧基。反应24 h后，逐滴加入终止剂乙醇/氨水溶液（7/3，V/V）。凝胶状沉淀物用乙醇离心洗涤后冷冻干燥48 h，得到白色粉末状脱氧胆酸接枝壳聚糖（CS-DA）。

1.2.2  N-乙酰-L-半胱氨酸接枝脱氧胆酸壳聚糖的合成  以N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）为亲水基团接枝CS-DA，制备两亲性壳聚糖[16-18]。将1 g CS-DA溶解于50 mL含有0.768 g Hobt水溶液中。另外，4 g NAC和2.908 g EDAC溶解在25 mL水中，并在室温下搅拌以活化NAC的羧基。将这2个混合液混合后调整溶液的pH为5，在45 ℃下避光反应3 h。反应结束后，用一定量无水乙醇洗涤抽滤。将洗涤后的沉淀溶解在水中，装入透析袋透析3 d。第1天，透析液为1 mmol/L盐酸和含有1%氯化钠水溶液，后2 d用含有0.2 mmol/L盐酸水溶液透析。经冷冻干燥得到两亲性壳聚糖固体粉末。

1.2.3  槲皮素纳米胶束的制备  采用自组装法制备了两亲壳聚糖纳米胶束。将5 mg 两亲性壳聚糖粉末溶解在10 mL去离子水中。在室温下超声处理10 分钟，得到两亲性壳聚糖空白胶束。然后将1 mg的槲皮素固体粉末添加到壳聚糖空白胶束中，混合均匀后在室温下超声处理15 min，形成包埋槲皮素的纳米胶束。

1.2.4  傅里叶红外光谱表征  将改性后的两亲性壳聚糖研磨成粉末，采用KBr压片法，FTIR测样品采集记录光谱数据，根据特征吸收峰推断其化学结构。扫描范围从4000 cm1到400 cm1，扫描间距为4 cm1[19]。

1.2.5  荧光分光光度计分析  采用荧光分光光度计法，以芘（1，6-二苯基-1，3，5-六三烯，DPH）作为荧光探针，测定两亲性壳聚糖空白胶束的临界胶束浓度（CMC）[20]。胶束测定浓度从5×104 ～5×107 mg/mL。在激发波长为338 nm，发射波长为360～450 nm的条件下，用F-7000荧光光谱仪对空白纳米胶束样品的荧光强度进行测量。选取第1个峰（373 nm）和第3个峰（405 nm）处的吸收峰强度比作为纵坐标，浓度对数作为横坐标，作图得到两直线，其交点为CMC。

1.2.6  扫描电子显微镜（SEM）分析  将纳米胶束滴加在铜网上自然晾干，通过扫描电镜在电压10 kV下观察槲皮素纳米胶束的表面形态。

1.2.7  粒度与电位测定  通过纳米粒度-电位分析仪对两亲性壳聚糖空白纳米胶束和槲皮素纳米胶束的粒度和zeta电位进行评估。样品浓度为1 mg/mL。测定槲皮素纳米胶束的粒度以及电位，每个指标测量3次。

1.2.8  包封率与载药率的测定  将槲皮素纳米胶束用离心机在8000 r/min 处理5 min，上清液为被包封的槲皮素，沉淀物是未包埋的槲皮素。用紫外分光光度计在370 nm波长下测量上清液的吸光度，用线性回归方程（Y=0.053 37X+0.0014， R2 = 0.999 57）计算槲皮素的含量。根据下式计算槲皮素包埋率（EE）和载药率（DL）：

1.3  数据处理

采用Origin 8软件进行统计分析，所有数据均以平均值±SD表示。当获得的P值小于0.05时表示有统计学意义。

2  结果与分析

2.1  近红外光谱分析

壳聚糖和两亲性壳聚糖的红外光谱谱图如图1所示。图1（a）显示CS的3个主要特征峰，1658 cm1 是C = O酰胺Ⅰ伸缩振动，1575 cm1是酰胺Ⅱ，N-H 脱乙酰胺弯曲振动，3429 cm1是O-H伸缩振动吸收峰。图1 （b） 是两亲性壳聚糖的红外光谱，2548 cm1为H-S吸收峰，1658 cm1为C=O吸收峰，与壳聚糖相比，增加2个特征峰。N-乙酰-L-半胱氨酸的特征峰2548 cm1处巯基特征峰的出现，证实亲水基团N-乙酰-L-半胱氨酸通过酰氨基键化学合到壳聚糖分子上。此外，1658 cm1处的新吸收峰表明DA的羧基与CS的游离氨基反应，形成新的酰胺官能团。通过红外光谱证实脱氧胆酸和N-乙酰-L-半胱氨酸成功接枝壳聚糖，形成新型两亲性壳聚糖。

2.2  两亲性壳聚糖纳米胶束的自组装

以芘为荧光探针，研究两亲性壳聚糖在水中的自组装行为。芘与两亲性壳聚糖纳米胶束疏水区域相接触，两亲性亲水端暴露在水环境中维持胶束稳定[21]。如图2所示，两亲性壳聚糖的临界胶束值为26.92 μg/mL。结果表明，随着两亲性壳聚糖浓度的增大，芘的发射光谱强度逐渐增大。由于芘所处介质的极性变化，使得芘发射光谱的振动峰强度随之变化。当壳聚糖溶液浓度低于17.78 μg/mL时，I373/I405值为1.135左右无显著变化，表明在此浓度范围内，两亲性壳聚糖仅以单链的形式分散在水中，非稳定胶束形式存在。当壳聚糖浓度高于17.78 μg/mL时，两亲性壳聚糖在水中自组装形成纳米胶束，分子间作用力提高，疏水性的芘由极性极强的水中转移到非极性的纳米胶束疏水微区中，导致发射光谱发生变化[22]。

2.3  槲皮素纳米胶束的粒径和电位分析

采用纳米粒度分析仪测得槲皮素纳米胶束粒度平均粒径约370 nm，呈正态分布，如图3所示。PDI值为0.234，粒径大小分布均匀主要集中在140～600 nm。研究表明，槲皮素在两亲性壳聚糖水溶液中完全溶解，且采用超声自组装法制备的纳米胶束粒径均匀。采用纳米粒度电位分析仪测量两亲性壳聚糖水溶液即空白纳米胶束电势为正，约43.2 mV。将槲皮素固体粉末溶解在空白胶束溶液中，采用超声自 组装的方法将槲皮素封装在带有正电荷的两亲性壳聚糖溶液中，所得载药纳米胶束电势减小约31 mV。由此说明，槲皮素纳米胶束的形成与静电作用有关。槲皮素纳米胶束最终电位大于30 mV，表明该体系相对较稳定。

2.4  槲皮素纳米胶束扫描电镜外观形态分析

由图4可以看出，槲皮素纳米胶束微观形态为球形，分布较为均匀。研究表明，槲皮素纳米胶束风干后的扫描电镜尺寸与纳米粒度及电位分析仪结果较为接近。

2.5  槲皮素纳米胶束的载药率和包封率

由槲皮素线性拟合方程，测得槲皮素的包封率和载药率随槲皮素投料量的增加而改变。包封率为79.96%、74.34%、69.56%、64.13%和61.07%，载药率为11.35%、15.42%、18.23%、22.96%和26.44%。计算得到平均包封率和载药率分别为69.81%和18.88%。從图5中可知，纳米载药胶束的包封率和载药率随芯材槲皮素投入量的增加而变化。当槲皮素投入量由50 μg增加到500 μg时，包封率由79.96%降低至61.07%，而载药率由原11.35%提升至26.44%。投入量由50 μg增加到300 μg时，载药率上升速度较快，包封率下降趋势较快，两者变化速率有相似规律。结果表明，两亲性壳聚糖纳米胶束对槲皮素具有较好的包埋能力，有利于槲皮素水溶度以及生物利用度的提高。

2.6  槲皮素纳米胶束体外释放分析

研究槲皮素纳米胶束在生理pH 7.4条件下分别在体温37 ℃和室温28 ℃的释放情况。图6是槲皮素纳米胶束的释放曲线，在前10 h，出现爆发式释放，随后释放速度减慢。在37 ℃下释放72 h时，累计释放率高达51.96%，在28 ℃下释放72 h时，累计释放率分别为22.37%。通过比较不同温度下槲皮素纳米微胶囊的释放情况，得出控制温度，纳米微粒结构在人体温37 ℃下不稳定，有利于槲皮素的释放。在室温28 ℃下，槲皮素纳米胶束释放缓慢较稳定，有利于其具有生物活性的芯材长期贮存。

3  讨论

通过傅里叶红外光谱分析确定合成的两亲性壳聚糖，红外测得在2540 cm1处出现巯基特征峰与Rajawat等[16]和Croce等[23]研究结果相似。通过接枝脱氧胆酸后形成新的酰胺官能团在1624 cm1处出现新吸收峰，此结果与Sukamporn等[12]的研究结果相似。以两亲性壳聚糖作为载体，制备槲皮素纳米胶束。两亲性壳聚糖纳米胶束载体，表现出更高的药物负载能力，特别是对于疏水药物，能有效的提高疏水药物利用率，增强药物靶向作用[24-25]。N-乙酰-L-半光氨酸接枝壳聚糖具有较好的生物相容性和生物可降解性，无毒性[26]。此外，壳聚糖改性后黏附性和通透性显著增强[27]。脱氧胆酸是胆汁酸中的主要成分，常作为疏水基团修饰亲水聚合物，制备两亲性自组装载体材料[28]。刘真真等研制的H-ESO-HEC两亲性聚合物临界胶束浓度测得292～ 336 μg/mL[29]。本研究以改性壳聚糖作为载体，通过芘作为疏水探针采用荧光分光光度计法研究得到，临界胶束值显著降低至26.92 μg/mL。能有效地降低成本，提高壳聚糖等原料的利用率。两亲性壳聚糖可在较低浓度下形成胶束，成本较低，有利于纳米胶束的开发利用。纳米胶束PdI值为0.234，证明超声处理有利于纳米粒子粒径均匀。通过Zeta电位研究表明，槲皮素纳米载药胶束在水性环境中带正电约31 mV，证明该体系较为稳定[30]。胶束微观结构为球形，与扫描电镜相似，表面光滑，比表面大，与普通纳米微胶囊结构相比有利于载药量的提升。利用紫外分光光度计法，测得槲皮素纳米胶束平均载药率和包封率分别为18.88%和69.81%，研究表明在芯材投入量在50 μg到500 μg的范围内，纳米胶束载药率与芯材投入量正相关，而包封率与其投入量负相关。由于疏水药物槲皮素与两性亲壳聚糖之间存在较强相互作用力，槲皮素投入量增加，作用力逐渐增大，槲皮素包埋率不断减小，载药率不断提高。在体外释放研究中，发现纳米胶束缓释受温度的影响。在人体体温37 ℃时，累计释放量显著高于室温（28 ℃），纳米胶束在热条件下不稳定，有利于槲皮素的释放，从而达到在体内加快释放却在室温条件下稳定贮藏的目的。开发有效的疏水药物载体在医药和食品中具有重大意义，能有效地提高疏水物质的生物利用率，纳米载体的应用加快了发展进程[22， 31]。以可降解生物无毒性的壳聚糖为原料制备的槲皮素纳米胶束，为槲皮素等疏水物质的开发利用提供新思路。

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