松果菊苷通过p53/p38MAPK/caspase信号转导途径改善db/db小鼠心肌细胞凋亡的机制研究

张祥 杨洛 徐雄峰

[摘要]目的 研究肉苁蓉提取物松果菊苷（Echinacoside，ECH）对糖尿病心肌病db/db小鼠模型心肌细胞是否具有保护作用及可能的作用机制。方法 将29只SPF级6周龄雄性db/db小鼠和db/m小鼠适应性饲养1周后，按照随机数字表法取9只db/m小鼠作为正常对照组（db/m组，n=9），将db/db小鼠分为糖尿病心肌病组（db/db组，n=10）与松果菊苷干预组（db/db+ECH组，n=10）。其中db/db组和db/m组每日按照0.05 ml/10 g标准进行生理盐水灌胃2周。db/db+ECH组小鼠按松果菊苷300 mg/（kg·d）灌胃2周。每周监测三组的小鼠体重，观察小鼠摄食、饮水及活动情况。于第10周用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠并处死，取尾静脉血测定空腹血糖（FBG）。采用HE染色观察心肌组织病理改变，采用Tunel染色法测定心肌细胞凋亡率，采用免疫印迹（Western blot）法检测凋亡相关蛋白p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8的表达水平，采用real-time PCR测定心肌细胞p53、p38MAPK mRNA和caspase mRNA、Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。结果 与db/m组相比，db/db组小鼠的体重、血糖和血脂水平显著升高（P<0.05或P<0.01）。HE染色切片显示，与db/m组比较，db/db组小鼠的心肌细胞可见明显肥大、坏死，心肌细胞排列结构紊乱；而db/db+ECH组小鼠的心肌细胞形态有所缓解，细胞间隙减少，排列较规则。Tunel染色观察心肌细胞凋亡指数显示，相较于db/m组，db/db组小鼠的心肌细胞凋亡程度显著增高（P<0.01），同时伴有p53蛋白、p38MAPK蛋白、caspase-3和caspase-8蛋白表达量显著升高（P<0.01），且p53、p38MAPK mRNA和caspase mRNA、Bax mRNA表达量明显上升，Bcl-2 mRNA水平下调即Bcl-2/Bax水平降低（P<0.01）。与db/db组比较，db/db+ECH组上述指标均有明显降低，且Tunel染色观察小鼠心肌细胞凋亡指数显著下降（P<0.01）。结论 松果菊苷能够明显改善db/db小鼠心肌细胞凋亡，其机制可能与通过p53/p38MAPK/caspase信号转导途径有关。

[关键词]松果菊苷；糖尿病心肌病；凋亡；p53；p38MAPK

[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章編号] 1674-4721（2019）5（a）-0013-06

[Abstract] Objective To study the protective effect of Echinacoside （ECH） from Cistanche deserticola extract on myocardial cells of diabetic cardiomyopathy db/db mice and its possible mechanism. Methods A total of 29 SPF grade 6-week-old male db/db mice and db/m mice were fed adaptively for one week， and 9 cses of db/m mice were selected as the normal control group （the db/m group， n=9） according to random number table method. The db/db mice were divided into the diabetic cardiomyopathy group （the db/db group， n=10） and the Echinacoside intervention group （the db/db+ECH group， n=10）. The db/db group and the db/m group were given saline for 2 weeks daily according to 0.05 ml/10 g standard. The mice in the db/db+ECH group were intragastrically administered with Echinacoside 300 mg/（kg·d） for 2 weeks. The weight of mice in three groups was monitored weekly， and the feeding， drinking and activity of mice were observed. At the 10th week， mice were anesthetized by intraperitoneal injection of 2% Pentobarbital Sodium and executed. The fasting blood glucose （FBG） was measured by tail vein blood. HE staining was used to observe the pathological changes of myocardial tissue， Tunel staining was used to determine the apoptotic rate of myocardial cells， Western blot was used to detect the expression levels of apoptotic-related proteins p53， p38MAPK， caspase-3 and caspase-8， and real-time PCR was used to detect the expression levels of p53， p38MAPK mRNA and caspase mRNA， Bcl-2 and Bax mRNA in myocardial cells. Results Compared with the db/m group， the body weight， blood glucose and blood lipid levels of mice in the db/db group increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. HE staining section showed that compared with db/m group， cardiac myocytes in the db/db group were obviously hypertrophic and necrotic， and the arrangement of cardiac myocytes was disordered. In the db/db+ECH group， the morphology of myocardial cells was alleviated， the intercellular space was reduced and the arrangement was regular. Tunel staining showed that the apoptotic index of cardiomyocytes in the db/db group was significantly higher than that in the db/m group （P<0.01）. At the same time， the expression of p53 protein， p38MAPK protein， caspase-3 and caspase-8 protein increased significantly （P<0.01）. The expression of p53， p38MAPK mRNA， caspase mRNA and Bax mRNA increased significantly， while the level of Bcl-2 decreased， that was the level of Bcl-2/Bax decreased （P<0.01）. Compared with the db/db group， the above indexes in the db/db+ECH group significantly decreased， and the apoptotic index of cardiomyocyte in mice was significantly decreased by Tunel staining （P<0.01）. Conclusion ECH can significantly improve the apoptosis of myocardial cells in db/db mice， and its mechanism may be related to the p53/p38MAPK/caspase signal transduction pathway.

[Key words] Echinacoside； Diabetic cardiomyopathy； Apoptosis； p53； p38MAPK

糖尿病心肌病是由糖尿病引起的广泛心肌血管病变和心肌代谢紊乱而导致的心肌坏死性疾病[1]。疾病早期舒张功能不全通常表现为心肌顺应性降低和舒张压降低；晚期收缩功能障碍是最常见的，且极易发生充血性心力衰竭[1]。由于糖尿病心肌病的发病机制复杂，其通常在晚期才被发现，所以目前没有特别有效的治疗方法[2]。

松果菊苷（Echinacoside，ECH）是一种从管花肉苁蓉茎中分离出来的天然化合物，其主要化学成分是苯乙醇苷[3]。其体内外研究已被证明具有抗氧化、抗疲劳、抗炎、提高记忆力与神经保护、抗肿瘤、保护肝脏及免疫调节等作用[4]。动物实验显示，预处理2 h的ECH组小鼠神经细胞及肝细胞凋亡率较对照组明显降低，caspase-3和caspase-8活性明显减弱[5]。其中caspase-3为关键的执行分子，其在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能[6]。为进一步揭示ECH保护糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的分子机制，本实验以db/db小鼠作为糖尿病心肌病模型，研究心肌细胞凋亡调控关键蛋白p53及其下游信号通路中重要蛋白激酶p38MAPK是否参与ECH保护心肌细胞凋亡的调控。

1材料与方法

1.1 实验动物

本实验采用从南京大学-南京生物医药研究院购买的成年雄性C57BLKS/J db/db小鼠和db/m小鼠（SPF级），其编号为SCXK（苏）2015-0001，购回后分笼饲养于武汉大学人民医院动物中心标准饲养房，室温20℃，相对湿度50%～60%，24 h昼夜光照循环，适应性饲养1周。

1.2仪器与试剂

电子天平（METTER TOLEDO公司）；全自动显微镜BX63（日本Olympus公司）；基因扩增仪（美国ABI公司）；实时荧光定量PCR检测仪（7500序列检测系统）（美国ABI公司）；DYY7C型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；成像系统（Q-IMAGING公司）。

ECH（上海融禾医药科技发展有限公司，批号：150623）、Trizol试剂（美国Invitrogen公司，批号：15596-026）；PT-PCR以转录试剂盒；荧光定量PCR试剂盒；Tunel试剂盒（美国Roche公司，批号：11684817910）；二甲苯（国药集团化学试剂有限公司，批号：10023418）；抗荧光淬灭封片剂（武汉阿斯本生物技术有限公司，批号：AS1089）；DAPI染液（武汉阿斯本生物技术有限公司，批号：AS1075）；

1.3方法

1.3.1分组及给药 同窝出生6周龄小鼠经检疫及适应饲养1周后，随机编號将db/db小鼠分为糖尿病心肌病组（db/db组，n=10）和ECH治疗组（即药物干预组）（db/db+ECH组，n=10）。选取9只db/m小鼠作为正常对照组（db/m组，n=9）。于8周龄时分别做如下干预：db/db组小鼠和db/m组小鼠每日按照0.05 ml/10 g生理盐水灌胃10周，同时db/db+ECH组小鼠按松果菊苷300 mg/（kg·d）灌胃10周。每周监测三组小鼠体重，观察小鼠摄食、饮水及活动情况。于第10周用2%戊巴比妥钠（上海禾丰制药，批号：120201）腹腔注射麻醉小鼠（0.1 ml/10 g），毛细血管针眼眶后采血，迅速分离血清，置于-80℃冰箱保存待测。心脏灌流后，分离心脏组织，称取心脏湿重，取一部分组织用4%多聚甲醛（谷歌生物科技有限公司，批号：WB1101）固定，用于做切片观察心肌组织形态，剩余心脏组织置于液氮1 h后保存在-80℃冰箱，用于Real-time PCR和蛋白印迹检测。

1.3.2观察指标 观察并记录实验期间各组小鼠的摄食、饮水、体重、行为和皮毛等一般情况。用全自动生化检测仪检测血清中血糖、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、三酰甘油（TG）。

1.3.3心脏组织切片Tunel染色心肌细胞凋亡水平 心肌细胞凋亡水平用Tunel试剂盒进行检测。细胞凋亡晚期过程中，细胞核DNA断裂，暴露的3′-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜进行检测细胞凋亡水平。心脏组织多聚甲醛预处理后，进行包埋、切片；然后依次将切片进行以下处理：放入二甲苯Ⅰ（20 min）-二甲苯Ⅱ（20 min）-无水乙醇Ⅰ（10 min）-无水乙醇Ⅱ（10 min）-95%乙醇（5 min）-90%乙醇（5 min）-80%乙醇（5 min）-70%乙醇（5 min）-蒸馏水洗涤；切片甩干后用组化笔画圈防止液体流走，圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37℃孵育15 min后，将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；取Tunel试剂盒内适量试剂1（TdT）和试剂2（dUTP）按1∶9混合后加入圈内覆盖组织，37℃水浴锅孵育60 min，加少量水保持湿度；PBS漂洗3次，每次5 min，加适量DAPI染液，室温避光孵育5 min；PBS漂洗爬片3次，每次5 min，从6孔板内取出爬片，将有细胞的一面封到滴加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.4 HE染色观察心肌组织病理改变 心脏组织切片，各组大鼠取5 μm大小心脏组织，用HE染色制片，放置在光学显微镜下观察心肌组织病理改变及心肌细胞凋亡程度。

1.3.5 Western blot法测定小鼠心脏组织中p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表达水平 取各组小鼠心脏组织50 mg，用组织剪剪成细小碎片，加蛋白裂解液混匀，然后加入适量终浓度为1 mmol/L的PMSF抑制组织蛋白降解，冰浴裂解20 min；1200 r/min离心10 min，吸取上清液，用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品及SDS-PAGE上样缓冲液（2×）按1∶1配平后，沸水浴变性10 min，取50 μg蛋白样品进行SD-PAGE电泳，湿转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶摇床封闭1 h，分别加入一抗稀释液（1∶800），4℃摇床过夜。细膜后，分别加入兔抗兔二抗稀释液（1∶5000），室温孵育1 h，洗膜后进行扫膜显色，并分析各组条带蛋白灰度值。每个指标对应组别连续检测两次，组别依次为db/m组、db/db组和db/db+ECH组。

1.3.6 Real-time PCR检测小鼠心脏组织中p53、p38MAPK mRNA和caspase-3 mRNA、Bcl-2/Bax mRNA的表达水平 取各组小鼠心脏组织100 mg，用Trizol法提取总RNA，用基因扩增仪逆转录成cDNA后，每个样本加入3个复孔。95℃预变性30 s，接着进行如下40个循环的扩增：PCR反应95℃ 5 s、60℃ 40 s；溶解95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s。选取管家基因GAPDH作为内参照，使用ABI7500软件2-ΔΔCT法处理数据，引物序列见表1。

1.4统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；相关指标之间采用直线相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠的一般情况及ECH对小鼠体重、心脏湿重、血糖的影响

研究结果显示，db/m组小鼠饮水、摄食正常，毛色光滑；而db/db组和db/db+ECH组小鼠饮水、摄食量增加，毛色粗糙，活动度降低，尿量增加。与db/m组相比，db/db组小鼠体重和血糖明显升高（P<0.01），db/db组小鼠心脏湿重明显下降（P<0.01）；而与db/db组相比，db/db+ECH组小鼠体重和血糖明显下降（P<0.05），心脏湿重明显升高（P<0.01）（表2）。

2.2 ECH对各组小鼠血脂水平及心脏功能的影响

与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠的ALT、AST及TG水平明显升高（P<0.01）；与db/db组比较，db/db+ECH组小鼠上述指标能得到显著缓解（P<0.01）（表3）。

2.3 ECH对各组小鼠心脏形态学的影响

HE染色显示，db/m组小鼠心脏形态正常，心肌细胞清晰紧密排列，结构清楚，少见细胞外基质和纤维组织；db/db组小鼠心肌细胞可见明显肥大、坏死，心肌细胞排列结构紊乱，可见少许胞外基质沉积；与db/db组相比，db/db+ECH组小鼠心肌细胞形态有所缓解，细胞间隙减少，排列较规则，胞外基质沉积改善（图1，封四）。

2.4 ECH对各组小鼠心肌细胞凋亡率的影响

db/m组心肌细胞的总凋亡率为（1.86±0.49）%，db/db组小鼠的心肌细胞凋亡率显著增加（P<0.01），为（31.66±2.89）%；而与db/db组相比，db/db+ECH组小鼠凋亡率显著降低（P<0.01），为（8.35±1.13）%，提示ECH对小鼠心肌细胞凋亡具有明显的改善作用（图1、表4）。

2.5 ECH对小鼠心脏组织p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表達的影响

与db/m组相比，db/db组小鼠的心肌细胞p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与db/db组相比，db/db+ECH组蛋白表达水平显著降低（P<0.01）（图2、表5）。

2.6 ECH对小鼠心脏组织中p53、p38MAPK、caspase-3、Bcl-2/Bax mRNA表达水平的影响

实验结果显示，与db/m组比较，db/db组小鼠的心肌细胞p53、p38MAPK、caspase-3 mRNA水平明显升高，Bcl-2/Bax水平降低（P<0.01）；经ECH干预后，db/db+ECH组相关mRNA水平较db/db组显著改善（P<0.01）（表6、图3）。

3讨论

糖尿病作为一种常见的慢性代谢紊乱症，已被描述成为“冠心病的等价物”，并且被更多的认为是一种心血管疾病而非碳水化合物的代谢紊乱[7]。糖尿病患者微血管疾病和大血管疾病危险因素增高，且患有心脏病的非糖尿病患者心脏死亡率与此相当[8-9]。不断有实验研究和临床证据显示，糖尿病心肌病心肌功能不全与心肌细胞凋亡引起的心肌损伤密切相关[10]。本研究中，实验动物db/db小鼠是由于瘦素受体基因异常剪接从而产生突变而具有明显的高血糖、高血脂、高胰岛素血症等2型糖尿病特征，并且可以维持较为稳定的高血糖状态，是糖尿病心肌病的常用造模对象[11]。

本实验通过对db/db小鼠进行ECH灌胃治疗，观察ECH对糖尿病小鼠心脏损伤的影响。结果显示，经ECH治疗后，db/db组小鼠体重、心脏湿重均明显下降，同时观测到血清葡萄糖水平亦有所降低（P<0.05），提示ECH对db/db糖尿病小鼠糖尿病症状有改善作用。能量代谢紊乱作为糖尿病心肌病的重要发病机制之一，参与了糖尿病心肌病的发生与发展[12]。ALT、AST和TG虽常用来检测肝脏代谢，但研究发现，其在心肌细胞损伤过程中，上述物质释放入血，血清水平会有所增高，并且血清TG水平增高的病理改变能够加重糖尿病心肌病心肌脂质沉积，进一步加速糖尿病心肌病的恶化[13]。通过检测血清中ALT、AST和TG水平发现，较db/m组相比，db/db组上述指标均明显升高，而ECH能够抑制血清ALT、AST和TG水平的升高趋势。

研究显示，高糖培养24 h的H9c2心肌细胞、p38MAPK表达增加，凋亡细胞增加，活性氧增加，线粒体膜电位下降[14]。高糖、AGEs、氧化应激等因素可通过p38MAPK通路引起细胞凋亡，机制可能与p53、Bax、Bcl-2、氧化应激等有关[15]。本研究中，db/db小鼠心脏组织中的p53、p38MAPK、caspase-3蛋白表达水平较db/m组明显升高；在db/db+ECH组小鼠心脏组织中，p53、p38MAPK、caspase-3水平较db/db组显著升高，Bcl-2/Bax mRNA水平显著降低，提示在糖尿病小鼠中p53/p38MAPK通路的激活，促进p38MAPK蛋白磷酸化从而激活下游相关凋亡蛋白caspase家族，上调caspase-3和caspase-8表达水平，启动细胞凋亡级联反应，抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达，上调促凋亡基因Bax的表达，最终导致心肌细胞凋亡；而经ECH灌胃处理后，db/db小鼠能够明显抑制p53/p38MAPK通路的激活，影响db/db小鼠的心肌细胞凋亡进程，并通过调节细胞凋亡通路关键蛋白的表达来保护心脏功能，这一点与HE染色及Tunel染色观察到的心脏组织形态学改变一致。

综上所述，在db/db小鼠心脏组织中，心肌细胞凋亡是其发生、发展糖尿病心肌病的重要病理机制，ECH能够保护db/db小鼠的心脏功能，其机制可能与抑制p53/p38MAPK/caspase信号通路，调节相关蛋白的表达从而改善心肌凋亡有关。

[参考文献]

[1]Hu X，Bai T，Xu Z，et al.Pathophysiological fundamentals of diabetic cardiomyopathy[J].Compr Physiol，2017，7（2）：693-711.

[2]Gilca GE，Stefanescu G，Badulescu O，et al.Diabetic cardiomyopathy：current approach and potential diagnostic and therapeutic targets[J].J Diabetes Res，2017，2017（21）：1 310 265.

[3]Fu G，Pang H，Wong YH.Naturally occurring phenylethanoid glycosides：potential leads for new therapeutics[J].Curr Med Chem，2008，15（25）：2592-2613.

[4]Wu Y，Li L，Wen T，et al.Protective effects of echinacoside on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in rats[J].Toxicology，2007，232（1-2）：50-56.

[5]Faria A，Persaud SJ.Cardiac oxidative stress in diabetes：mechanisms and therapeutic potential[J].Pharmacol Ther，2017，172：50-62.

[6]Julien O，Wells JA.Caspases and their substrates[J].Cell Death Differ，2017，24（8）：1380-1389.

[7]Naito R，Miyauchi K.Coronary artery disease and type 2 diabetes mellitus[J].Int Heart J，2017，58（4）：475-480.

[8]Wu Y，He J，Sun X，et al.Carotid atherosclerosis and its relationship to coronary heart disease and stroke risk in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Medicine （Baltimore），2017，96（39）：e8151.

[9]Liu J，Liu FH，Zhao YN，et al.Glucose excursion in senior patients with type 2 diabetes mellitus and coronary artery disease[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2017，97（20）：1562-1567.

[10]Zhao Y，Ponnusamy M，Dong Y，et al.Effects of miRNAs on myocardial apoptosis by modulating mitochondria related proteins[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2017，44（4）：431-440.

[11]Lee KH，Seo JW，Ho LS，et al.Effect of mycophenolate mofetil on diabetic cardiomyopathy in db/db Mice[J].Rev Esp Cardiol （Engl Ed），2016，69（4）：449-450.

[12]Alonso N，Moliner P，Mauricio D.Pathogenesis，clinical features and treatment of diabetic cardiomyopathy[J].Adv Exp Med Biol，2017，2（4）：124-130.

[13]Liu Y，Neumann D，Glatz JFC，et al.Molecular mechanism of lipid-induced cardiac insulin resistance and contractile dysfunction[J].Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2016，52（49）：221-224.

[14]Chen J，Guo R，Yan H，et al.Naringin inhibits ROS-activated MAPK pathway in high glucose-induced injuries in H9c2 cardiac cells[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2014，114（4）：293-304.

[15]Huang H，Wu K，You Q，et al.Naringin inhibits high glucose-induced cardiomyocyte apoptosis by attenuating mitochon-drial dysfunction and modulating the activation of the p38 signaling pathway[J].Int J Mol Med，2013，32（2）：396-402.

（收稿日期：2018-09-25 本文編辑：祁海文）