利用表面预烯基化纳米硅胶颗粒制备新型液相色谱整体柱

2019-06-20李金祥杨芮萌马世雍

长春师范大学学报 2019年6期

李金祥，杨芮萌，李佳，马世雍

(辽宁师范大学化学化工学院，辽宁大连 116029)

毛细管液相色谱由于其柱效高，重复性好，样品和溶剂消耗低，分离过程中色谱稀释度大大降低，与质谱联用相容性好等优点在分离领域受到越来越多的关注[1-2]，现如今，除了生物学以及药学之外，医学行业也大量应用了这一技术[3-4]。当填充到整体柱里面的固定相填料变化的时候，能够把整体柱一共划分成3个不同的类型，分别是有机聚合物整体柱、无机二氧化硅整体柱以及有机与无机杂化整体柱。有机聚合物整体柱尽管制备起来难度较低，但在有机溶剂中极易溶胀；无机二氧化硅整体柱制备需要花费大量的时间，并且表面改性所涉及的工作量也十分繁杂；有机与无机杂化整体柱克服了上述的缺点并结合了两者的优点，因此广泛地应用于毛细管液相色谱领域。

在本次研究当中，所使用的交联剂为表面预烯基化的无机纳米硅胶颗粒，该交联剂的直径为20～50 nm，2-二甲基乙基胺甲基丙烯酸酯(DAMA)与甲基丙烯酸(MAA)作为有机功能单体，在毛细管(外径375 μm，内径150 μm)内原位聚合，成功得到了有机与无机杂化两性离子交换整体柱。除此以外，本次研究的测试对象为一价无机阴离子以及有机胺类阳离子各一组，使用这两个测试对象对整体柱的分离性能进行了全面地评估。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

本实验所需用到主要仪器见表1,所用试剂和材料见表2。

表1 实验所用仪器

表2 实验所用试剂和材料

1.2 纳米硅胶颗粒表面预烯基化处理

实验中使用的纳米硅胶颗粒是按照文献[5]报道，采用油包水反相微乳法合成的二氧化硅纳米颗粒，其直径在20～50 nm之间。将纳米颗粒用1.0 mol·L-1NaOH溶液浸泡60 min，高速离心后用超纯水浸泡60 min，洗到中性，用1.0 mol·L-1HCl溶液浸泡60 min，高速离心后用超纯水浸泡60 min，洗到中性，最后加入甲醇，浸泡约30 min后使用烘箱烘干。量取相同体积的预烯基化试剂γ-MAPS与甲醇，制成混合溶液，注入纳米颗粒中，放入恒温水浴中，温度控制在45℃，反应12 h。高速离心后用甲醇浸泡60 min，最后放入烘箱烘干。

1.3 毛细管内壁预烯基化处理

将内径150 μm的毛细管内壁进行预烯基化处理，具体方法同纳米硅胶颗粒预烯基化处理。

1.4 整体柱的制备

共需要配制3种溶液，分别为甲、乙、丙。甲溶液是一种三元致孔剂，其组分为水、甲醇以及环己醇，(H2O∶MeOH∶CyOH=l∶l∶2，v/v/v)，乙是有机单体混合溶液(DAMA∶MAA=1∶1，v/v)，丙是用甲溶液配制的浓度为2%(w/v)的AIBN溶液。3种溶液均需要通入氮气除氧,然后再使用超声来进行振荡。称取7.5 mg表面预烯基化的纳米硅胶颗粒，22.5 μL乙溶液和60 μL甲溶液于1.5 mL的离心管中,通入氮气除氧，并使用超声振荡，再加入10 μL丙溶液后，通入氮气并超声振荡30 s，由此获得均匀的聚合反应液[6]。在注射器中添加一定量的聚合反应液，并快速把它注入到经过预处理的毛细管里，之后把毛细管的两侧都密封，放置在恒温水浴里，温度控制在60℃，反应10 h，接着再用甲醇以及水对整体柱进行冲洗，水与甲醇的量要超过柱体积的50倍。最后可得到有机与无机杂化两性离子交换整体柱。

2 结果与讨论

2.1 整体柱制备条件的优化

为了制备固定相结实耐压，孔隙均匀渗透性好，分离效能高的两性离子杂化整体柱，本研究对整体柱的制备条件进行了严格设计，对聚合反应时间、单体的总浓度以及致孔剂的组成配比等进行了深入研究。聚合混合物一共由几种物质所构成，分别为：纳米硅胶颗粒(7.5 mg)+DAMA(11.25 μL)+MAA(11.25 μL)+环己醇(35 μL)+甲醇(17.5 μL)+水(17.5 μL)+AIBN(0.2 mg)；反应温度：60℃；反应时间：10 h。

2.2 色谱分离

对于两性整体固定相而言，它同时拥有-NH2与-COOH两种基团，对流动相的酸碱度进行调整之后，可控制上述两个基团质子化程度。当pH改变之后，固定相表层的电子密度以及电荷性质也会受到影响，所以，实现了阴离子分离模式和阳离子分离模式的转换。

2.2.1 阴离子分离

(a)pH=3

(b)pH=3.3

(c)pH=3.6

(d)pH=3.9

(a)[CI-]=50 mmol·L-1

(b)[CI-]=70 mmol·L-1

(c)[CI-]=90 mmol·L-1

(d)[CI-]=110 mmol·L-1

由图3可见，通过调节流动相pH值和竞争离子浓度，可利用较短的整体柱(1 cm)在较短的时间(3 min)实现3种阴离子的快速分离。具体实验条件为:紫外检测波长210 nm；有效柱长1 cm；流动相：10 mmol·L-1H3PO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=3.6，[Cl-]=90 mmol·L-1；流速：0.9 μL·min-1。

图3 三种阴离子的快速分离图

2.2.2 有机阳离子分离

流动相在碱性条件下，-NH2的质子化程度会比-COOH更小，固定相整体带负电荷，所以此时可借助静电作用来分离阳离子。本研究的流动相为H3PO4-Na2HPO4缓冲溶液，溶液浓度为20 mmol·L-1，通过调节pH值的变化来考察对3种有机胺类阳离子保留时间的影响，具体实验条件：紫外检测波长214 nm；有效柱长4.5 cm；流动相：20 mmol·L-1H3PO4-Na2HPO4缓冲溶液，40%ACN；流速：0.8 μL·min-1。组分：(1)对甲苯胺；(2)对氯苯胺；(3)对硝基苯胺。由图4可见，随着pH值的增加，3种有机阳离子保留时间增加。

(a)pH=7

(b)pH=8

(c)pH=9

在碱性条件下，有机胺类阳离子的分离机理较复杂，除与阳离子的静电作用外，固定相的亲水性同样对阳离子的保留时间有一定的影响，具体实验条件为：紫外检测波长214 nm；有效柱长4.5 cm；流动相：20 mmol·L-1H3PO4-Na2HPO4缓冲溶液，pH=7；流速：0.8 μL·min-1；组分：(1)对甲苯胺；(2)对氯苯胺；(3)对硝基苯胺。由图5可见，由于阳离子与固定相间存在着亲水作用，提高流动相里乙腈占比，固定相与阳离子两者间的相互作用力会有所削减，因此分离效果不佳。进而可以证明有机胺类阳离子与固定相之间为离子交换机理和亲水作用的共同作用。

(a)30%ACN

(b)40%ACN

通过上述实验可知，对流动相的酸碱度以及其中添加剂的占比进行改变，就能够让有机胺类阳离子在较短的时间内实现分离，具体实验条件为：紫外检测波长214 nm；有效柱长4.5 cm；流动相：20 mmol·L-1H3PO4-Na2HPO4缓冲溶液，pH=7，40%ACN；流速：0.8 μL·min-1。组分：(1)对甲苯胺；(2)对氯苯胺；(3)对硝基苯胺。由图6可见，利用较短的整体柱(有效柱长4.5 cm)可在较短时间(5 min)内实现快速分离。