家蚕转基因技术及其应用

2019-06-20郝志华谢玉凯黄晓冰马维苑

广东蚕业 2019年4期

关键词：转座子蚕丝家蚕

吴　骏　罗　漫　郝志华　谢玉凯　黄晓冰　马维苑　田　铃

家蚕转基因技术及其应用

吴骏罗漫郝志华谢玉凯黄晓冰马维苑田铃

（华南农业大学动物科学学院广东广州 510642）

自家蚕基因组测序完成以来，家蚕的相关研究进入了后基因组时代，也使得家蚕的转基因技术得以迅速的发展。文章介绍了家蚕中转基因的技术及其发展现状，为今后的基因编辑技术、转基因家蚕研究以及生物反应器等应用提供了借鉴与参考。

家蚕；转基因；基因编辑；生物反应器

自20 世纪80年代开始，在世界范围内掀起了动物转基因技术的研究热潮。1984年，我国开始了转基因动物的研究，并取得了一系列成果，如：含人—珠蛋白基因的转基因小鼠的构建[1]、含乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔的获得，以及我国首例转基因克隆牛的诞生[2]，这些都标志着我国在转基因领域有了一定的研究进展。

家蚕（）为鳞翅目绢丝昆虫，是我国重要的特种经济动物，主要以桑叶为食，分泌的蚕丝是一种天然的纺织原料。蚕丝产业曾在我国出口创汇和脱贫致富中发挥着重要的作用，但是随着我国经济结构的调整以及社会需求的转变，传统蚕桑产业已经发展到瓶颈期，如何进行传统产业改革、利用家蚕进行多元化开发已成为当今家蚕研究领域的一个热点与难点。

2004年我国科学家率先完成了家蚕基因组的测序工作，使得我国家蚕遗传或是分子生物学的研究开始走在世界的前列。同时，随着基因组学相关技术的不断深入与发展，尤其是基因组精准编辑技术和转基因家蚕技术的不断推进，使其在家蚕科学研究中的应用也越来越广泛。以转基因技术为工具，对家蚕的功能基因进行遗传操作，进而尝试表达目的蛋白或者改变家蚕经济性状已经成为了研究热点。本文综述了近年来适用于家蚕转基因的技术和转基因应用成果，以期为今后的相关研究提供参考。

1 家蚕转基因技术

1.1 家蚕转基因技术操作的方法

转基因技术指的是将外源DNA片段利用基因工程技术导入特定的受体中，使之与受体的基因进行重组，并稳定表达的一种实验技术。在家蚕中常用的操作方法有：显微注射法、精子介导法、基因枪法等。

1.1.1 显微注射法

显微注射技术是一种通过显微注射操作仪将外源物质、细胞核或细胞注入到受体中的微操作技术，应用广泛且效果良好。Tamura[3]等于1990年建立家蚕显微注射操作技术，并成功获得了相应的转基因家蚕品系。目前，利用显微注射法进行家蚕转基因操作已经非常成熟，并有了很多创新，如Sun[4]等构建了两个转基因RNAi载体，并利用显微注射法获得了具有浓核病抗性的转基因家蚕品系。但是，该方法对仪器和操作人员的技术有一定的要求，且可能会导致卵体受伤、孵化率低等问题。

1.1.2 精子介导法

精子介导法是一种利用精子能瞬间吸收外源基因的特性，将整合了外源目的基因的载体与精子进行预培养，使部分精子带上外源基因，在受精时与卵细胞结合，达到基因重组目的的一种方法。具体可分为先注后交法、先交后注法、人工受精法。郭秀洋[5]等、Zhou[6]等都利用该方法成功得到转基因家蚕，验证了该方法的可行性。

1.1.3 基因枪导入法

基因枪导入法又被称为粒子轰击技术，孟智启[7]等于1992年首次使用该方法，成功将金属粒子以550 ～ 600 m/s的轰击速度冲破卵壳打入卵内，经过检测大多数卵发育正常，利用该方法一些科学家获得了表达目的基因的转基因家蚕品系。

1.1.4 其他方法

除上述几种常用的方法外，转基因家蚕的操作方法还包括压力渗透导入法 (osmoticmethod, OM)[8]、脉冲场电泳法(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、电穿孔导入法(electroporation)及脂质体转染法等，都有一定的可行性。

1.2 家蚕转基因载体

转基因载体是一类装载有外源 DNA并且能使其随自身复制而得到扩增的DNA构造，它可以将外源DNA在一定条件下插入到宿主基因中。转基因载体包括一些固有的元件，如启动子、转座子序列等。在进行转基因实验时，除了注意目的基因的导入方法和导入时期外，选择合适的启动子和构建合适类型的载体也是影响实验的关键因素。

1.2.1 家蚕转基因所用载体的启动子

启动子是一段能识别、结合RNA聚合酶并使自身活化、启动转录的一段DNA序列。在转家蚕基因的研究中，适合的启动子是决定外源基因能否成功表达的重要因素之一。目前常见的家蚕转基因所用载体的启动子有肌动蛋白A3启动子[9]、人工启动子3Xp3[10]、热激蛋白启动子[11]、抗菌肽启动子、家蚕丝心蛋白启动子[12]和家蚕核型多角体病毒早期即刻蛋白基因启动子[13]等。

1.2.2 家蚕转基因所用载体类型

1.2.2.1 基于转座子的载体

piggyBac转座子是一种DNA转座子，由于存在可携带较长的基因片段、整合效率较高等优点，它在家蚕的转基因技术中得到了广泛应用。在2000年，Tamura[14]等首次将piggyBac转座子应用于家蚕中，其将家蚕细胞质肌动蛋白（BmA3）启动子和绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因连在含piggyBac的末端重复序列的质粒上，与含有piggyBac转座酶基因的辅助质粒共同注射于胚胎前期蚕卵中，虽然成功获得转基因品系，但是表达效果并不理想。针对BmA3启动子效率较低的问题，Horn和Wimmer将piggyBac载体进行改进，之后Thomas[15]用改进的piggyBac载体注射蚕卵，并取得较好的表达效果。

minos转座子是一种可在家蚕胚胎和营养细胞中转移DNA的转座元件[16]，Shimizu[17]、Uchino[18]等先后将其应用于家蚕转基因研究中。Mosl元件也可应用于家蚕转基因研究中，Wang[19]等利用其成功将外源基因导入体外培养的家蚕细胞（Bm5）中，由于minos转座子和Mosl元件都具有插入位点不确定性的缺点，因此后来都被piggyBac转座子所取代[20]。

1.2.2.2 基于病毒的载体

研究发现，杆状病毒和逆转录病毒也可以充当载体，将目的基因高效地整合到家蚕基因组中，是一种良好的家蚕转基因工具。杆状病毒主要以家蚕核型多角体病毒（BmNPV）和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）为主，其原理主要是将目的基因插入到病毒的特定位点，利用病毒的特性，使外源基因整合到家蚕基因组中。相关的研究有，张峰[21]等利用家蚕细胞质肌动蛋白基因（A3）启动子和NPV病毒即刻早期蛋白IE启动子成功在家蚕细胞中表达了GFP基因。

逆转录病毒的应用起步于20世纪90年代末，Nikolaev[22]等、Chan等先后利用逆转录病毒的LTR序列分别介导外源基因整合到家蚕、牛的基因组中；后来，河本夏雄等利用反转录病毒的LTR序列将GFP基因导入家蚕体细胞，并对G0代幼虫进行了RCR检验，发现了病毒载体成功侵入胚胎细胞中，逆转录出了cDNA。

1.2.2.3 基因打靶载体

随着相关技术的提升，基因打靶技术在转基因家蚕研究中得到一定的应用，即利用同源重组原理，将外源基因定向地融合进靶细胞基因组中的某个位点。自20世纪80年代兴起后，逐渐被科学家用来对某一确定位点的基因进行定点突变，以达到修饰基因的目的。相较于较常用的piggyBac转座子载体，它可以有效的克服转座子随机整合的问题。1999年，Yamao[23 ]等将GFP基因与丝素轻链第7外显子融合，利用AcMNPV载体，将GFP基因打靶进蚕卵母细胞基因组丝素轻链中，并得以表达。2002年，朱成钢[24]等将基因与家蚕丝心蛋白轻链基因融合，构成一种新型的转基因家蚕打靶载体pBacF53 TG。

1.2.2.4 其他基因载体

据相关报道，YAC载体也可应用于家蚕转基因中。李振刚[25]等利用YAC载体将天蚕丝基因整合于家蚕基因组中，获得绿茧家蚕品系。

2 基因编辑技术在家蚕转基因中的应用

基因编辑技术是指通过人工核酸酶对动物特定的内源性基因进行目地性的修饰, 如敲除、敲入、定点突变等, 并结合体细胞核移植与胚胎移植等技术手段, 以此获得被修饰编码的个体。基因编辑技术最早适用于基因的定点突变和敲除，其目的主要是在未引入外源基因的情况下对生物体进行基因组上的精准操作。但是随着技术的发展，通过基因编辑工具，也可以实现准确和简便的基因敲入，所以也可以把基因敲入编辑的生物认为是转基因生物。

目前，基因编辑技术主要发展了3代：分别是锌脂核酸内切酶(zinc finger endonucleases, ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸内切酶(transcription activatorlike effector endonucleases, TALENs) 和CRISPR/Cas9 [clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/Cas9(CRISPR associated 9) ]技术[26]。其中 TALEN技术和CRISPR/Cas9 技术目前应用最为广泛，两者各有优点，TALEN技术具有高度的特异性，而CRISPR/Cas9 技术的操作更简便。

表1　基于人工核酸内切酶的基因组靶向编辑技术在家蚕转基因中的应用

截止2018年部分数据

3 家蚕转基因技术的应用

在众多科学家的不懈努力情况下，家蚕转基因技术开始应用于各个领域，主要在基础研究领域、家蚕遗传育种和生物反应器方面的应用。

3.1 在基础研究领域的应用（功能基因组领域）

转基因技术可以应用于家蚕功能基因的研究，探究家蚕基因的作用和家蚕生长发育的调控机制。例如，Uhliová[31]等人利用piggyBac转座子介导的转基因技术成功地研究了核受体基因的功能。结果显示，的表达在家蚕每次蜕皮过程中受蜕皮激素的控制。在研究家蚕幼虫体壁半透明基因基因的过程中，Fujii[32]等利用转基因技术发现，该基因突变后的家蚕与油蚕幼虫表皮中尿酸转化成尿酸颗粒的过程受到抑制。除此之外，Tan[33]、Hongjiu[34]等也通过转基因技术结合GAL4/ USA双元转基因系统进行了一系列研究。

在不同品种的转基因家蚕中，外源基因的表达效果可能存在差异，所以将家蚕基因的启动子或者增强子序列与基因形成融合基因，再以此获得转基因家蚕，则可通过基因的表达情况，来显示目的基因的表达调控，确定有利于目的基因表达的家蚕品系。Kurihara[35]等人就通过相关实验发现丝胶缺乏家蚕在转基因方面的应用潜力。

3.2 在家蚕遗传育种领域的应用

随着现代社会的高速发展，传统品系的家蚕已经难以满足多元化的市场需要。相对于传统的家蚕育种方式，利用转基因技术进行家蚕育种，将特定的功能基因导入家蚕中，使之表达特定的性状，这样的品种往往能表现出传统家蚕品系没有的特征。目前已经有很多科学家从事这方面工作，并取得了一些进展。

3.2.1 抗性品种培育

自古以来，蚕病一直就是困扰蚕桑产业的一大难题。目前，主要的蚕病有病毒病、细菌病、真菌病等。其中，BmNPV病毒病具有易传染、致病性强的特点，是蚕桑产业中最容易造成经济损失的病原之一，也是蚕桑科学研究的主要对象。在2004年，Isobe[36]等人首次利用转基因技术，将RNA干扰BmNPV的片段在家蚕中过表达，使家蚕对BmNPV有了一定的抵抗力，这为培育家蚕抗病品种提供了新的思路。随后，Kanginakudru[37]等人通过干扰BmNPV的基因，发现得到的转基因家蚕抗BmNPV感染力有了明显的提升。在此基础上，蒋亮[38]等科学家也对此做了一系列后续研究，取得了突破性的进展。

3.2.2 蚕丝品质改良

蚕丝主要以丝素和丝胶为主，还含有蜡、碳水化合物、色素、灰份和天然杂质等，是一种优质的蛋白纤维[39]，但蚕丝也存在不抗皱、不耐磨、产量不足等缺点。2011年，马俐[40]等利用GAL4/UAS双元转换系统将促癌基因在家蚕体内过量表达，大大提高了蚕丝产量，证实了转基因技术应用的可能性。除此之外，蚕丝的多元化应用也成为了研究重点，如李珍[41]等成功研究出了具有抗菌功能的蚕丝。

3.3 在生物反应器领域的应用

目前家蚕生物反应器主要是利用 piggyBac转座系统将外源基因在家蚕后部丝腺中表达外源蛋白，形成家蚕丝腺生物反应器（包括丝胶表达系统和丝素表达系统），同时也有研究人员开始进行家蚕脂肪体生物反应器和家蚕血淋巴生物反应器的研究，尝试以不同特点的家蚕组织表达不同类型的蛋白。

3.3.1 丝腺生物反应器

家蚕丝腺分为前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺三个部分，前部丝腺具有导管作用；中部丝腺合成丝胶蛋白，其中主要由、、三个基因编码；后部丝腺合成丝素蛋白，由 391 kDa的丝素重链（Fib-H）、26 KDa的丝素轻链(Fib-L)和 30 KDa的 P25 蛋白以6∶6∶1的摩尔比组成并作为蚕丝的基本结构单位[42]。家蚕丝腺具有高效的合成和分泌蛋白的能力，所以大多数科学家都用丝腺来表达外源基因，并取得了不错的进展。

在2002年，Tomita[43 ]等首次利用 piggyBac转座子介导的转基因成功利用家蚕丝腺合成了人 III型前胶原蛋白，经检验在蚕茧中发现了该种蛋白。这有力地证明了丝腺作为生物反应器的可能性。Ogawa[44]等在2007年利用piggyBac载体在转基因家蚕蚕茧的丝胶层中成功表达并分离了重组人血清白蛋白（recombinant human serum albumin, rHSA），并通过研究发现其构象和功能与天然产物相同。后续还有研究表明家蚕的丝腺可以产生小鼠蛋白的单抗[45]、人脑源性神经营养因子[46]、狂犬病毒核蛋白[47]等。

此外，2018年Xu[48]等人还利用 TALEN技术，将家蚕丝素蛋白 H链敲除并敲入了蜘蛛丝蛋白基因，成功利用家蚕丝腺高表达了蜘蛛丝蛋白，其方法和意义值得关注和研究，家蚕丝腺作为生物反应器的应用前景巨大，值得进一步研究。

3.3.2 脂肪体生物反应器

脂肪体是昆虫体内的中间代谢器官，它起到了合成和代谢蛋白质、脂类和糖类、降解有毒物质等重要生理作用[49]。其分泌的蛋白有储存蛋白、脂蛋白等多种功能蛋白[50]。

部分学者针对这些功能，进行了相关研究。幸俊逸[51 ]等于2010年通过显微注射技术，将含有主要抗原位点的O型口蹄疫病毒VPI结构蛋白基因为标靶的piggyBac表达载体成功导入家蚕胚胎，获得转基因蚕。经验证，重组口蹄疫 VPI蛋白成功在家蚕脂肪体中表达。刘耀文[52]等也成功通过转基因技术在家蚕脂肪体表达了重组植酸酶。此外，胡莹莹[53]等利用非转座子系统培育转基因家蚕，在脂肪体中也得到了有效表达。

3.3.3 血淋巴生物反应器

家蚕血淋巴是家蚕血液与家蚕淋巴液的混合体，是一个开放的系统，内含物丰富，其中就含有大量的蛋白质，它们在家蚕的生长发育过程中起到了重要作用。

Susumu[54]等于1985年利用了杆状病毒表达载体在家蚕中成功表达了人α-干扰素，活性达到了5×107U/50 µg。随着研究的深入，重人乳蛋白[55]、P25 蛋白和 Fib-L蛋白[56]、Aβ42 和 CTB-Aβ15 蛋白[57]等都被科学家在家蚕血淋巴中成功地表达。可见，以家蚕血淋巴作为生物反应器的可行性还是非常高的。

4 存在的问题

家蚕作为鳞翅目的模式昆虫，具有生长周期短、易饲养、繁殖率高、遗传背景清楚等优点。在进行转基因研究时，家蚕可以使用人工饲料饲养，且成虫无法飞行，即可以隔离饲养，这也为转基因研究带来了便利，当然存在的问题也很明显：

（1）转座子随机整合：转座子随机整合会导致目的基因的表达发生变化，即上调表达、下调表达和异位。这可能会导致转基因家蚕出现基因层次的负面变化，进而影响整个实验。目前已经有部分科学家正在研究条件基因打靶技术解决转座子随机整合问题[58]。

（2）标记基因保留带来的隐患：上文中提到，在家蚕转基因相关操作中，标记一般会保留在转基因个体的基因组中，但是这会增加转基因逃逸的可能性，且存在影响目的基因表达的可能性。针对这一问题，位点特异性重组法是目前转基因动植物中应用比较广泛的解决方法之一。早在2012年，Long等[59]利用一种基于酿酒酵母（）的FLP/FRT系统的方法，成功定点敲出了标记基因。

（3）外源基因导入后的表达效率：和很多转基因生物一样，转基因家蚕也存在外源基因表达效率不高等问题。尤其是在家蚕生物反应器方面，外源基因的整合率和表达水平较低一直困扰着研究人员。

5 结语和展望

随着遗传学和分子生物学技术的发展，越来越多的新技术、新成果将应用于家蚕转基因领域。伴随研究的深入，转基因技术在家蚕育种及资源的品质创新等方面展现了其他技术无法比拟的优势和潜力，如果我们加以合理的应用，必将为传统蚕桑产业的升级发展和创新应用带来新的机遇。

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