“武当二号金银花”和“武当三号金银花”不同药用部位中木犀草素的含量测定

李聪，李鹏，纪春草，郑芳，朱雪松，李志浩，刘慧敏，熊琳，黄麟杰

作者单位：1湖北医药学院附属东风医院药学部，武当特色中药研究所湖北省重点实验室，湖北 十堰 442000；2湖北医药学院药学院，湖北 十堰 442000

湖北武当生物医药科技有限公司将“亚特良种金银花”与来源于武当地区金银花结合进行培育，培植出适合武当地区生长的3个优良独特品种，分别“武当一号金银花”、“武当二号金银花”、“武当三号金银花”。鉴于本地区光照条件好、雨量充沛、四季分明，适合药材生长的优越自然条件，已推广种植，我市金银花基地达到4万余亩，其中培植“武当三号”已成为全省最大的红色金银花基地，总产量高达2 000余吨，市场前景广阔。本课题组已从采收期、不同花期、不同干燥方法、提取工艺研究等方面，分别对武当二号金银花、武当三号金银花不同药用部位，如花蕾、藤中的绿原酸、芦丁和木犀草苷等不同有效成分进行了分析研究[1-5]，研究初步表明其有效成分绿原酸、木犀草苷含量远高于《中国药典》 (2015年版)中“金银花”项下相应规定[6]，且产量高出金银花3～5倍以上。

“忍冬”之名远早于金银花，最早出现于东晋葛洪著《肘后备急方》，记载“忍冬茎叶锉数壶煮”，故本草中最早用“忍冬”为药名，宋代之前只用茎、叶；明代则以茎、叶、花共同入药，其后主要以花入药为主，茎叶则分列为另一种药材，以“忍冬藤”为名。现代研究表明，忍冬藤、忍冬叶亦具有清热解毒、抗菌消炎、疏风通络的功效[7-12]。因此，本课题组对优质量、高产量的3个独特的“武当金银花” 品种进行深加工和综合利用，具有较高的社会效益和经济效益。本研究自2016年10月至2017年10月以木犀草素为质控指标，分别对武当二号金银花、武当三号金银花的花蕾、叶、藤不同药用部位进行分析比较研究，旨在为推进本地区武当金银花的资源开发和综合利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪(DIONEX，型号：UltiMate 3000)；WTF20002电子天平(杭州万特衡器有限公司，d=0.01 g)；METTLER TOLEDO电子分析天平(d=0.01 mg)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司，型号：频率(50±1)Hz，FW100型)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号：额定频率40 kHz，KQ-500DE型)；电热恒温干燥箱(兰州宏瑞食品有限公司，型号：202型)。

1.2 试药木犀草素对照品(中国药品生物制品检定所，批号111720-200604)；“武当二号金银花”和“武当三号金银花”的花蕾、叶、藤分别于2015年5月23日、2016年5月18日、2017年5月20日采自湖北武当生物医药科技有限公司赛武当金银花种植基地，并经湖北医药学院陈吉炎教授鉴定为忍冬科植物忍冬(LoniceraJaponicaThunb.)的花蕾、茎枝和叶；高效液相所用甲醇和乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 药材的预处理新采的三批(20150523，20160518，20170520)“武当二号金银花”和“武当三号金银花”的花蕾、叶和藤，用清水洗净，将藤剪成约2 cm茎枝段，蒸汽杀青(花蕾、叶和藤分别约蒸3、6、10 min)后，置45 ℃电热恒温干燥箱干燥、粉碎后过筛(花蕾和叶的干燥粉末过四号筛，藤的干燥粉末过三号筛)，干燥粉末经过筛后置密闭的棕色瓶，并置干燥器中，于冰箱中保存(2～4 ℃)，备用。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取木犀草素对照品3.84 mg，置50 mL棕色量瓶中，用甲醇稀释，得到浓度为76.8 μg/mL的对照品储备液；精密量取适量上述储备液，用85%乙醇稀释10倍，得浓度为7.68 μg/mL的对照品溶液。上述溶液均用封口膜封上，置2～4 ℃冰箱中备用。

2.2.2供试品溶液的制备 精密称取“2.1”项下预处理的“武当二号金银花”干燥的花蕾、叶和藤(简称二蕾、二叶和二藤)粉末和“武当三号金银花”干燥的花蕾、叶和藤(简称三蕾、三叶和三藤)粉末各一份(其中二蕾、二藤和三蕾约1 g；二叶、三叶和三藤约0.5 g)，置具塞锥形瓶中，加85%乙醇各20 mL，称量，超声处理(超声功率：500 W，频率：40 kHz，超声温度：40 ℃)45 min，放冷，再称量，用85%乙醇补足减失的重量，摇匀，用有机相过滤头(0.22 μm)过滤，弃去初滤液，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件与系统适应性色谱柱：Fortis-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液(50∶5∶45)；流速为0.6 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为350 nm；进样量为20 μL。在此色谱条件下，分别进样“2.2.2”项下木犀草素对照品溶液和供试品溶液，记录色谱图(图1)。结果：木犀草素色谱峰保留时间约为17 min，理论塔板数以木犀草素色谱峰计不低于6 600，其DAD匹配值均不低于999.4，分离度均不低于2.0。

图1 HPLC色谱图(λ=350 nm)：A为对照品图；B为三号叶供试品图；C为三号藤供试品图；D为三号花供试品图

2.4 标准曲线的绘制精密吸取“2.2.1”项下木犀草素的对照品储备液适量，共6份，用甲醇稀释成浓度分别为1.536、3.072、6.144、9.216、12.288、15.36 μg/mL的对照品溶液，分别进样20 μL，记录木犀草素色谱峰面积。以进样浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得木犀草素回归方程为Y=3.4039X+0.1967(r=0.999 5)。结果表明木犀草素在1.536～15.36 μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验精密吸取“2.2.1”项下浓度为7.68 μg/mL的对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积，测得木犀草素峰面积的RSD为0.93% (n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验取批号为20170520的“武当三号金银花”叶干燥粉末，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，平行操作制备6份，按“2.3”项下色谱条件各进样20 μL，记录峰面积，结果木犀草素峰面积的RSD为1.62%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验取批号为20170520的“武当三号金银花”叶干燥粉末，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液1份，分别于0、4、8、12、16、20、24 h按“2.3”项下的色谱条件进样20 μL，记录峰面积，结果木犀草素峰面积的RSD(n=7)分别为1.37% (n=7)，表明在24 h内供试品溶液稳定。

2.8 加样回收率试验取批号为20170520的“武当三号金银花”叶的干燥粉末0.25 g(每1 g叶中含木犀草素为0.233 mg)，共9份，分三组，精密称定，分别精密加入“2.2.1”项下的浓度为7.68 μg/mL的木犀草素对照品溶液6.0、7.5、9.0 mL(低、中、高各三份)于上述三组样品中，按“2.2.2”项下三叶供试品制备的方法制备溶液，依据“2.3”项下色谱条件进样20 μL,测定木犀草素的峰面积，并按标准曲线计算的含量。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.9 样品含量测定分别取3批(20150523，20160518，20170520)按“1.3”项下方法预处理及储存的“武当二号金银花”和“武当三号金银花”干燥的花蕾、叶和藤适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件各进样20 μL,测定木犀草素的峰面积，并按标准曲线计算含量。结果见表2。结果表明，“武当二号金银花”和“武当三号金银花” 三个部位的干燥品在遮光、密闭、低温条件下贮藏，比较适宜，含量方面武当三号金银花三个部位木犀草素含量含量较二号高，且含量次序均为叶>藤>花蕾，其中叶中含木犀草素的含量几乎为花蕾的3倍。

表2 3批药材中木犀草素含量测定结果/(mg/g)

3 讨论

3.1 供试品提取条件的优化本实验在前期课题组的实验基础上，分别比较了加热回流、索氏及超声几种提取方式，最后确定超声提取作为本实验供试品处理的最佳提取方式[1-5]。在500 W超声功率、40 kHz超声频率、(40±2)℃的超声温度条件下，分别对超声提取时间(30、45、60、75、90 min)、提取溶剂(55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇)及不同的物料比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)等方面做了系列考察，结果在提取溶剂为85%乙醇、超声时间为45 min时，两种药材三个部位中的木犀草素基本提取完全，武当二号的花蕾、藤与武当三号花蕾适宜物料比为1∶20，武当二号叶、武当三号叶和武当三号藤适宜物料比为1∶40。

3.2 色谱分析条件的选择在波长范围为190～400 nm内，采用二极管阵列检测器对木犀草素对照品溶液进行全波长光谱扫描，结果在350 nm附近有最大吸收，故选择该波长为该试验木犀草素的检测波长。本实验在甲醇和磷酸水溶液做为流动相组分的基础上，虽然只加入了少量乙腈，但对木犀草素的出峰时间、峰形、峰纯度及柱效的改善，起了一定作用。当甲醇-乙腈-0.4%磷酸为50∶5∶45时，出峰时间适宜(小于20 min)，峰形好，柱效和峰纯度均较高[1]。

3.3 储存条件及不同药用部位对有效成分差异的影响本课题组曾对“武当二号金银花”和“武当三号金银花”的花蕾期、银花期及金花期木犀草苷的分别进行测定，结果花蕾期较银花期、金花期含量高，故本文选择花蕾为研究对象。本实验考察了两种药材三个部位在遮光、密闭、2～4 ℃贮藏条件下，随着贮藏时间的延长，木犀草素的含量下降3%～5%，表明 “武当二号金银花”和“武当三号金银花” 三个部位的干燥样品在遮光、密闭、低温条件下贮藏适宜；含量方面，三个部位木犀草素含量的高低次序均为叶>藤>花蕾，三个部位含量差异较大，其中叶中含木犀草素的含量几乎为花蕾的3倍。结合本课题组前期研究成果[1-3,5]，“武当三号金银花”中木犀草苷在花蕾、叶、藤中的平均含量分别为0.169、5.86、1.045 mg/g，芦丁的平均含量分别为0.152、3.46、0.548 mg/g，初步表明其含量高低次序叶>藤>花蕾，验证了本草考证中“宋代之前只用茎、叶”的有效性。目前金银花叶、藤作为副产物，一年四季均可采摘，同时产量约为花及花蕾的10倍之多，但目前金银花叶被开发利用较少。由此，笔者认为可进一步扩大金银花的药用部位，以最大限度利用金银花资源。

本实验采用HPLC-DAD法测定“武当二号金银花”和“武当三号金银花”花蕾、叶和藤中木犀草素的含量，该方法简单快速，灵敏准确，重复性好，不同采收期对叶、藤等有效成分种类及含量差异的影响有待进一步研究，旨对武当金银花的循环综合利用研究奠定基础。