泛素E3连接酶对多发性骨髓瘤细胞增殖、克隆形成能力的影响

纪 超，马炬雷，舒 鹏

宁波市北仑区人民医院 浙江大学附属第一医院北仑分院 1检验科 2手足外科 3分子实验室，浙江宁波 315800

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是骨髓中浆细胞异常增生的一种恶性肿瘤，属于成熟B细胞肿瘤，其特征是单克隆浆细胞过度增生(超长增生)，并产生单克隆免疫球蛋白，骨髓中单克隆浆细胞的异常增生及侵犯骨髓，引起骨骼破坏、骨痛或骨折、贫血、高钙血症、肾功能不全及免疫功能异常。MM的预后极差，复发率极高，被认为是一种不可治愈的疾病[1]。MM依赖的信号通路十分复杂，其中重要的信号通路为核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路，在MM中有50%～70%患者存在NF-kB信号通路的持续异常激活[2]，同时NF-κB通路的抑制与MM细胞活性密切相关[3]，因此运用靶向治疗药物硼替佐米抑制NF-κB通路能够收到很好的效果，但随着靶向治疗药物不断地运用于治疗，肿瘤的耐药以及肿瘤的复发成为亟待解决的问题[4]，MM的耐药中，泛素化通路至关重要，泛素是存在于细胞中的一种小分子，泛素分子能够通过泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3等一系列酶的催化从而结合到靶蛋白，同时泛素的解离主要通过去泛素化酶完成[5]，泛素与靶蛋白的结合最早被认为通过泛素-蛋白酶体途径降解靶蛋白，随着研究的深入，泛素被认为是一种重要的翻译后修饰方式，参与了蛋白的定位、细胞周期等过程[6]，泛素化通路对于MM耐药的研究主要集中于泛素连接酶E3与去泛素化酶，其中泛素连接酶E3 Pirh2可通过c-myc、p53参与硼替佐米诱导的细胞增殖、凋亡和周期调控[7]，去泛素化酶USP7抑制剂则已投入到临床的使用中，泛素E3连接酶(denticleless E3 ubiquitin protein ligase，DTL)则属于泛素连接酶E3的一种[8]，其在MM中的表达研究较少。本研究主要阐述DTL在多发性骨髓瘤患者中的表达及其相应的生物学意义，并简要探讨其相关机制。

材料和方法

材料1640基础培养基(货号：11875127)与胎牛血清(货号：11573397)购自美国Gibco公司，人淋巴细胞分离液购自天津灝洋生物技术有限公司(货号：LTS1077N)，CD138+细胞磁珠分选试剂盒购自美国Stem cell公司(货号：18000)，人MM细胞系RPMI8226购自北京协和细胞库，对照(control，CON)组与DTL敲低(DTL-short hairpin RNA，DTL-shRNA)组慢病毒载体购自美国Sigma公司，CCK8细胞增殖检测试剂盒购自日本同仁化学研究所(货号：CK04)，甲基纤维素粉末购自美国Sigma公司(货号：M0512)，实时定量PCR引物由北京奥克鼎盛公司合成，DTL一抗购自美国赛默飞公司(货号：PA5- 42842)，P65(货号：8242)、磷酸化P65(货号：3033)、抑制因子κBα(inhibitory subunit-κBα，IκBα)(货号：5209)、磷酸化IκBα(货号：2859)、GAPDH(货号：5174)、β-actin(货号：3700)一抗均购自美国Cell Signal Technology，相应二抗均购自北京中杉金桥公司，所有一抗二抗均为单抗，ECL发光液购自美国赛默飞司(货号：NCI5080)，膜联蛋白 V别藻蓝素/碘化丙啶双染试剂盒购自天津三箭生物公司(货号：AO2001- 11P-G)，细胞周期中高浓度碘化丙啶染料购自美国Sigma公司(货号：P4170)，核蛋白提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司(货号：C500009)，NF-κB与有机阳离子转运蛋白- 1对照生物素标记探针购自碧云天公司，序列为NF-κB 正向：5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC- 3’ NF-κB 反向：5’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG- 3’；有机阳离子转运蛋白- 1 正向：5’-TGTCGAATGCAAATCACTAGAA- 3’，反向：5’-ACAG-CTTACGTTTAGTGATCTT- 3’。

细胞培养与分组初发MM患者与健康志愿者骨髓标本来自宁波市北仑区人民医院，RPMI8226 37 ℃、5% CO2培养于1640+10% 胎牛血清，RPMI8226分别分为CON与DTL-shRNA组，分别感染10感染复数(病毒∶细胞=10∶1)的CON与DTL-shRNA慢病毒。

CD138+细胞分离提取健康志愿者和骨髓瘤患者骨髓标本使用PBS溶液稀释4倍后，加入到等体积的淋巴细胞分离液中，1500 r/min(转子半径116 mm)密度梯度离心后，吸取位于中间的淋巴细胞层，从而得到单个核细胞，骨髓瘤标本单个核细胞进一步CD138+细胞磁珠分选试剂盒分离提取CD138+细胞，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

CON与DTL-shRNA慢病毒包装纯化CON与DTL-shRNA慢病毒包装采用Addgene第3代慢病毒包装系统：VSV-G包膜质粒∶HIV- 1病毒骨架质粒∶目的质粒=1∶3∶4转染至293t细胞中，分别收取36、48、72 h病毒上清，聚乙二醇沉淀纯化并分装。

CCK8检测骨髓瘤细胞增殖骨髓瘤细胞系RPMI8226感染CON与DTL-shRNA慢病毒48 h后，分别种于96孔板中，每孔3000细胞，设立副孔，加入1/10体积的CCK8试剂，37 ℃孵育3 h，酶标仪检测450 nm吸光度，分别在0、24、48、72、96 h检测，并以0 h为对照，分别计算24、48、72、96 h与0 h的比值，实验重复3次，取平均值以判定细胞增殖的变化。

克隆形成实验(1)取4000个CON与DTL-shRNA RPMI8226细胞置于2 ml完全培养基中，并加入白介素- 6使终浓度为40 ng/ml。(2)细胞悬液与2 ml 甲基纤维素1640溶液混合。2 ml 甲基纤维素1640溶液配制：8 g甲基纤维素粉末加入200 ml超纯水中，转子搅拌至甲基纤维素溶解，将1640粉末按2倍的量加入到100 ml超纯水中，二者等体积混合得到2 ml 甲纤1640溶液。(3)将上述混合液加入到24孔板中，每孔1 ml，即设立3副孔。(4)10 d后倒置相差显微镜观察克隆形成情况，大于50个细胞的细胞群即认为是克隆。

实时定量PCR细胞总RNA使用RNA提取试剂盒提取，使用 实时定量PCR检测两组细胞中DTL mRNA的表达水平，DTL 正向：5’-ATTGCTACCTGTTCTGATGA- 3’，DTL 反向：5’-CTGGCTACTCGTTACTGTT- 3’；GAPDH 正向 5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG- 3’，反向5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA- 3’ 。按染料法荧光定量试剂盒反应体系进行PCR扩增反应。以GAPDH基因为内参，并采用2-△△Ct法计算DTL在mRNA的相对表达量，实验重复3次，取平均值。

免疫印迹采用Western blot法，CON与DTL-shRNA RPMI8226细胞放射免疫沉淀法缓冲液细胞裂解液冰上裂解30 min，加入相应体积的蛋白上样缓冲液，煮沸10～15 min后得到Western blot样本，按照30 μg的量加入Western blot预制胶，50 V恒压待样本溴酚蓝至积层胶与分离胶分界线时，切换至120 V恒压，溴酚蓝至胶板底部时，400 mA恒流将蛋白样本转至聚偏二氟乙烯膜上，加DTL(1∶1000)、P65(1∶1000)、磷酸化-P65(1∶1000)、IκBα(1∶1000)、磷酸化-IκBα(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗，37 ℃孵育4 h，孵育相应二抗(1∶5000)，电化学发光免疫测定液显影，Quantity One 1-D分析软件对蛋白质印迹条带进行定量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白测定值/ GAPDH，实验均重复3次，取平均值。

凝胶迁移实验

RPMI8226骨髓瘤细胞核蛋白提取：使用上海生工生物工程股份有限公司核蛋白提取试剂盒，操作步骤参照试剂盒说明书进行。

凝胶迁移实验：(1)生物素标记探针与核蛋白结合后，按照8 μg的上样量加入到凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)胶中，60 V恒压，待溴酚蓝至胶板底部时，中止电泳。(2)安装转膜三明治，将核蛋白转至尼龙膜上，使用紫外灯在距膜5～10 cm处照射10 min进行紫外交联反应。(3)样本使用封闭液封闭15 min，洗涤液洗3次后，加入电化学发光免疫测定发光液，后续步骤同Western曝光。

细胞凋亡实验RPMI8226 CON和shRNA细胞在感染病毒48 h后，选取20 万细胞，使用PBS洗两次，并使用凋亡试剂盒中结合缓冲液洗1次，100 μl结合缓冲液 重悬后，加入 5 μl 膜联蛋白 V 别藻蓝素和5 μl 碘化丙啶染料，冰上标记10 min后，流式细胞仪检测细胞凋亡的变化，凋亡细胞的比例即为膜联蛋白 V阳性细胞的比例。

细胞周期实验RPMI8226 CON和shRNA细胞在感染病毒48 h后，选取100万细胞，使用PBS洗两次后，使用300 μl 5%胎牛血清的PBS重悬，并加入700 μl无水乙醇(最终比例为70%)固定过夜，PBS洗两次后，加入终浓度为1 μg/ml的RNA酶，37 ℃水浴30 min，加入终浓度为50 μg/ml的碘化丙啶染料，避光室温孵育20 min，流式细胞仪检测细胞周期的变化。

统计学处理使用SPSS 20.0软件进行分析，采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义，对于重复测量数据，使用重复测量方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，本研究全部流式数据使用FLOWJO 7.6.1软件进行分析[9]。

结 果

DTL在骨髓瘤患者CD138+细胞中的表达选取14例健康志愿者骨髓单个核细胞以及34例初发骨髓瘤患者CD138+细胞，34例多发性骨髓瘤患者中，年龄平均(68.43±10.29)岁，其中男28例、女6例，CD138+细胞比例为(38.21±26.47)%，M蛋白为(36.63±15.85)g/L，14例健康志愿者骨髓单个核细胞与34例骨髓瘤患者CD138+细胞中，DTL的表达量分别为1.00±0.12 和 9.36±3.71(t=3.65，P=0.0024)，并同时选取其中12例骨髓瘤样本，以2例健康志愿者骨髓单个核细胞为对照，Western blot检测DTL在骨髓瘤样本中的蛋白水平的表达，结果显示相对于健康志愿者骨髓单个核细胞，DTL在骨髓瘤患者中的表达显著提高。

DTL-shRNA慢病毒感染效率与敲低水平CON与DTL-shRNA组RPMI8226骨髓瘤细胞系感染病毒48 h后，首先使用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白阳性细胞的比率，结果显示两种病毒对于骨髓瘤细胞系的感染效率均为90%(图1A)，使用实时定量PCR检测DTL在RNA水平的改变后显示，CON组与DTL-shRNA组的DTL相对表达量分别为1.00±0.01 和 0.21±0.04(t=33.19，P<0.0001)，使用Western blot检测DTL在蛋白水平的改变后显示，CON组与DTL-shRNA组的DTL相对表达量分别为0.52±0.13 和 0.11±0.02(t=5.399，P=0.0057)(图1B)。

CON：对照组；DTL-shRNA：DTL泛素E3连接酶敲低组；Mr：相对分子质量

CON：control group；DTL-shRNA：denticleless E3 ubiquitin protein ligase-short hairpin RNA group；Mr：relative molecular mass

A.流式细胞仪检测感染效率；B.Western blot检测在蛋白水平的敲除效率

A.detection of the infection efficiency by flow cytometry；B.detection of kock-down efficicency at protein level by Western blot

图1RPMI8226感染10 感染复数 CON和DTL-shRNA组慢病毒48 h后DTL-shRNA对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226感染及敲除效率

Fig1DTL-shRNA infection and knock-down efficiencies in human multiple myeloma cell line RPMI8226 after RPMI8226 is infected by 10 folds of CON and DTL-shRNA lentivirus for 48 hours

骨髓瘤DTL的下调抑制细胞增殖和细胞克隆形成，并促进凋亡与细胞周期阻滞CON与DTL-shRNA组 0、24、48、72、96 h的细胞相对数量分别为1.00±0.03比 1.00±0.02、2.19±0.28 比 1.47±0.13、3.50±0.14 比 2.24±0.19、5.43±0.41比 3.08±0.14、7.42±0.17 比 4.29±0.13，Mauchly球形检验P=0.006，因此采用多变量方差分析方法，结果显示不同组之间随时间变化差异有统计学意义(F=24.58，P=0.001)。将CON与DTL-shRNA细胞分别培养于半固体培养基中10 d，倒置相差显微镜检测克隆形成后发现，CON组细胞克隆形成能力正常，视野中有大于50个细胞的克隆形成(白色箭头处)，而DTL-shRNA组细胞的克隆形成能力受到完全抑制，镜下大于50个细胞的克隆不可见，同时凋亡形态细胞显著增加(白色箭头处)(图2A)，而CON与DTL-shRNA克隆形成数量分别为76±4比0(P<0.01)。同时检测CON与DTL-shRNA 细胞周期的变化，结果显示CON与DTL-shRNA组G1期细胞比例为(28.61±8.64)%比(57.25±10.37)%(t=3.675，P=0.0213)(图2B)，在细胞凋亡中，CON与DTL-shRNA组膜联蛋白 V+细胞比例为(3.21±0.89)%比(34.71±18.68)%(t=2.895，P=0.0443)(图2C)。

DTL-shRNA对增殖、克隆形成的抑制与NF-κB通路的下调RPMI8226感染10感染复数 CON与DTL-shRNA慢病毒48 h后，使用Western blot检测NF-κB通路P65亚基磷酸化的水平后显示，CON与DTL-shRNA组磷酸化-P65相对表达量分别为1.52±0.14 和 0.82±0.11(t=6.81，P=0.0024)，而P65的表达分别为0.25±0.04和0.24±0.08(t=0.19，P=0.85)，差异无统计学意义，CON与DTL-shRNA组磷酸化-IκBα的相对表达量分别为0.19±0.03 和 0.13±0.02(t=2.882，P=0.0449)，而IκBα的相对表达量分别为0.22±0.05和1.01±0.06(t=17.52，P<0.0001)(图3A)。以有机阳离子转运蛋白- 1探针为对照，进一步使用EMSA检测DTL-shRNA NF-κB转录活性的变化，结果表明DTL-shRNA组NF-κB转录活性显著下调(图3B)。

A.半固体培养基中培养10 d倒置相差显微镜观察克隆形成(白色箭头处：典型克隆或凋亡细胞)(×100)；B.碘化丙啶染色法检测细胞周期的变化；C.膜联蛋白 V/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡的变化

A.culture in semisolid medium for 10 days and detection of the change of colone formation using inverted phase contrast microscope(white arrow：classic colone or apoptosis cells)；B.detection of the change of cell cycle by propidium iodide staining；C.detection of the change of cell apoptosis by annexin V/propidium iodide double staining

图2RPMI8226感染10 感染复数 CON和DTL-shRNA慢病毒48 h后，DTL-shRNA抑制RPMI8226增殖、克隆形成，促进凋亡与细胞周期阻滞

Fig2DTL-shRNA inhibits RPMI8226 proliferation and colone formation and induces apoptosis and cell cycle arrest after RPMI8226 is infected by CON and DTL-shRNA lentivirus for 48 hours

NF-κB：核因子-κB；P-P65：磷酸化P65;IκBα：抑制因子κBα；P-IκBα：磷酸化IκBα；EMSA：凝胶迁移实验；OCT- 1：有机阳离子转运蛋白- 1

NF-κB：nuclear factor-κB；P-P65：phosphorylation P65；IκBα：inhibitory subunit-κBα；P-IκBα：phosphorylation IκBα；EMSA：electrophoretic mobility shift assay；OCT- 1：organic cation transporter- 1

A.使用Western blot检测NF-κB通路P65、IκBα磷酸化水平变化；B.EMSA检测NF-κB转录活性的变化

A.detection of P65 and IκBα phosphorylation change in NF-κB pathway by Western blot；B.detection of the change of NF-κB transcriptional ability by EMSA

图3RPMI8226感染10感染复数 CON和DTL-shRNA慢病毒48 h后，DTL-shRNA引起细胞增殖改变与NF-κB通路改变相关

Fig3Effect of DTL-shRNA on cell prolieration is related with NF-κB pathway alteration after RPMI8226 is infected by CON and DTL-shRNA lentivirus for 48 hours

讨 论

尽管以硼替佐米为代表的MM靶向治疗具有很好的效果，随着耐药的逐渐增多，开发新的靶向治疗药物成为研究的热点，越来越多的研究表明泛素化通路与MM的发生发展密切相关，其中usp7特异性抑制剂已在临床应用，同时泛素E3连接酶Pirh2也被证实与MM的硼替佐米耐药相关。DTL做为一种泛素E3连接酶，其作用主要为将泛素分子与靶蛋白连接，继而介导靶蛋白的降解、定位等生物学进程，DTL同时也是反式维甲酸介导的人畸胎瘤细胞系nt2分化中重要的下游基因[10]，同时DTL也是一种备受关注的癌基因，在胃癌中，DTL的表达与淋巴结侵袭、肿瘤复发及患者生存率相关且与p53的突变无相关性[11]，在结肠癌中DTL高表达且作为MiR- 30a- 5p的靶点进而调控细胞的增殖[12]。而DTL在MM中的表达以及与增殖、克隆形成能力的关联则报道较少。

本研究首先选取34例MM患者与14例健康志愿者骨髓，在分离出单个核细胞后，由于MM中CD138+细胞表达异常升高，因此使用磁珠分选试剂盒分选出CD138+细胞，使用实时定量PCR检测DTL的表达后显示，DTL在骨髓瘤患者CD138+细胞中高表达，在确定了DTL mRNA水平的高表达后，由于Western blot所需细胞数量较多(需100万细胞)，部分骨髓瘤患者CD138+细胞比例较低，且每例患者仅获得5 ml骨髓，获得细胞较少，因此选取其中12例CD138+细胞比例较高患者，同时受Western胶上样数量的限制，选取2例健康志愿者骨髓单个核细胞为对照，2例对照样本DTL mRNA表达量位于中间水平，结果表明相对于健康志愿者血液单个核细胞，DTL在蛋白水平同样高表达，初步证实DTL可能为MM中的癌基因。因此进一步使用RPMI8226细胞系分别感染CON与DTL-shRNA病毒，并使用CCK8方法检测骨髓瘤细胞增殖变化，结果表明DTL的下调能够显著抑制细胞增殖，在48、72 h差异具有统计学意义，细胞克隆形成能力能够很好地反映细胞增殖、侵袭和对杀伤因素敏感性，结果表明DTL-shRNA使骨髓瘤细胞系克隆形成能力完全受限，镜下DTL-shRNA组克隆不可见，DTL的敲低同时能够促进RPMI8226的凋亡，并使得细胞周期中G1期细胞比例显著降低，证实了DTL的过表达对于骨髓瘤细胞系生物学功能的维持至关重要。NF-κB是骨髓瘤发生发展中起到关键作用的通路，NF-κB因子包括P65、P50等5种亚基，通常情况下两种亚基形成的二聚体与抑制因子IκBα结合而以无活性的状态存在[13]，各种胞外信号如肿瘤坏死因子α[14]、白介素- 2[15]等作用于膜受体后，激活磷酸化κB抑制蛋白激酶的作用，磷酸化κB抑制蛋白激酶使得IκBα与NF-κB亚基磷酸化，IκBα随机与泛素分子结合并降解，NF-κB亚基则磷酸化激活并入核，进而转录下游分子[16]。使用蛋白印迹与EMSA实验检测骨髓瘤细胞中NF-κB通路的变化，结果表明DTL敲低后，NF-κB通路P65亚基磷酸化受到抑制，抑制因子IκBα磷酸化同时降低，且IκBα表达升高，IκBα磷酸化以及随后的泛素化直接导致IκBα的降解[17]，因此，DTL-shRNA使得IκBα降解受到了抑制，EMSA实验检测NF-κB转录活性的变化后发现NF-κB转录活性显著降低，DTL对NF-κB通路影响的机制可能如下：(1)DTL的功能主要为介导泛素分子与靶蛋白的结合，已有研究证实，与DTL具有相似功能的鼠双微基因2蛋白能够通过与慢性粒细胞中的P65基因的启动子转化蛋白1结合，从而诱导P65亚基的表达[18]，DTL可能通过相似的机制影响NF-κB通路。(2)本研究同时观察到DTL的敲除能够诱导IκBα亚基的磷酸化，同时促进IκBα的降解，IκBα降解的增加通常与泛素化水平的升高密切相关[19]，DTL敲除能够使肿瘤细胞泛素通路受损，IκBα降解降低，进而使NF-κB通路受到抑制。因此，DTL敲低对于骨髓瘤细胞增殖、克隆形成能力的影响与NF-κB通路的抑制有关。

综上，本研究结果显示DTL在MM中的表达，并论证了DTL对骨髓瘤细胞增殖、克隆形成能力的影响及相关机制，为后续开发DTL特异性抑制剂提供了依据，缺点在于本研究纳入骨髓瘤标本数量较少(mRNA 34例、蛋白水平12例)，对于DTL在骨髓瘤患者中的表达水平论证不充分，因此，在今后的研究中，需进一步纳入新的骨髓瘤患者病例，并尝试在癌症和肿瘤基因图谱、基因表达汇编公共数据库中得到验证。