一株猪源产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

张青娴，徐引弟，王治方，朱文豪，许 峰，王克领

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002）

β-内酰胺类抗生素为目前临床使用率很高的抗生素，约占抗生素总使用量的30%～40%。近年来，随着β-内酰胺类抗生素的广泛应用，细菌尤其革兰氏阴性菌迫于生存压力对其耐药性已经产生，耐药菌株逐年增多，且呈交叉耐药和多重耐药之趋势[1]。β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制是能产生超广谱 β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases,ESBLs），且ESBLs细菌携带ESBLs质粒的同时可能带有对喹诺酮类、氨基糖甙类和磺胺类等药物的多种耐药基因，使其具有多重耐药表型，给临床治疗带来严重的威胁，成为临床关注的焦点[2-4]，大肠埃希氏菌和克雷伯氏菌是ESBLs的主要携带者[5]。

为指导兽医临床合理用药，促进养殖业的发展，笔者于2018年3月对河南省农业科学院畜牧兽医研究所传染病研究室分离得到的大肠杆菌，进行了ESBLs的基因型检测。经分离培养和PCR检测等方法，确认为TEM型ESBLs大肠杆菌，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2018年3月，本实验室采集河南省某猪场发生腹泻的仔猪病料，经组织培养、革兰氏染色、分离纯化和PCR检测等方法分离到3株大肠杆菌。

1.1.2 主要试剂、培养基等 麦康凯（Mac conkey,MC）琼脂、普通营养琼脂、革兰氏染色液等试剂购自北京奥博星生物公司。药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。Taq PCR master mix、DL 2 000 DNA Marker、GoldView等PCR试剂购自宝生物（大连）有限公司。胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA提取试剂盒等购自上海生工生物有限公司。头孢他啶（CAZ）及头孢他啶/克拉维酸（CAZ/CA），头孢噻肟（CTX）及头孢噻肟/克拉维酸（CTX/CA）等药敏纸片、M-H（Muller-Hinton Medium）琼脂培养基购自杭州滨和微生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分离鉴定 将采集的病料无菌接种MC培养基，置于37℃温箱培养18 h后，挑取单个玫红色菌落做革兰氏染色镜检，将疑似大肠杆菌的单菌落接种于普通营养琼脂培养基中纯培养后做PCR鉴别试验。用于鉴别大肠杆菌的上游引物P1：5′-ATGA AAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3′，下游引物 P2：5′-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3′，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.2 药敏试验

（1）纸片扩散法初筛ESBLs表型。将过夜培养的受试菌（菌液浊度0.5麦氏单位）均匀涂布于无菌M-H琼脂培养皿上，同时贴上头孢他啶CAZ（每片含 30 μg）、头孢他啶/克拉维酸（CAZ/CA，每片含 30 μg/10 μg）、头孢噻肟 CTX（每片含 30 μg）、头孢噻肟/克拉维酸（CTX/CA，每片含 30 μg/10 μg），各纸片中心距20～25 mm；37℃过夜培养，分别测量抑菌环直径。任意一组加克拉维酸比不加克拉维酸的抑菌环直径≥5 mm即可确认为ESBLs阳性菌株。

（2）检测ESBLs阳性菌株的药物敏感性。采用K-B法测定ESBLs分离菌株对常用抗菌药物的敏感性。所选药敏纸片包括7大类18种抗生素：阿米卡星（AK）、四环素（TE）、氨苄西林（AMP）、阿莫西林（AMX）、卡那霉素（K）、氧氟沙星（OFX）、头孢噻呋（EFT）、恩诺沙星（ENR）、头孢唑林（CZ）、复方新诺明（STX）、新霉素（N）、头孢哌酮（CFP）、氟苯尼考（FFC）、链霉素（S）、庆大霉素（GM）、环丙沙星（CIP）、头孢他啶（CAZ）、头孢噻肟（CTX）。

1.2.3 PCR基因分型 参考GenBank中大肠杆菌ESBLs耐药基因相关序列，设计4对引物如下，CTX-M 基因：F 5'-AAAAATCACTGCGCCAGTTC-3'，R5'-AGCTTATTCATCGCCACGTT-3'；TEM 基因：F5'-CATTTCCGTGTCGCCCTTATTC-3'，R 5'-CGTTCATC CATAGTTGCCTGAC-3'；SHV 基因：F 5'-AGCCGCTT GAGCAAATTAAAC-3'，R 5'-ATCCCGCAGATAAAT CACCAC-3'；OXA 基因：F 5'-ATGAAAAACACAAT ACATATCAACTTCGC-3'，R 5'-GTGTGTTTAGAATGG TGATCGCATT-3'。

将纯培养后的菌液提取DNA作为PCR模板，分别按如下反应体系进行PCR扩增，13 μL Taq PCR master mix、5 μL dd H2O、1 μL P1（上游引物）、1 μL P2（下游引物）、5 μL 模板。PCR 反应程序为：94℃变性5 min→94℃ 50 s→50～56℃退火45 s→72℃ 40 s，共30个循环，72℃延伸10 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.4 耐药基因序列比对 将阳性PCR产物回收后提取质粒，送至上海生工生物工程有限公司测序，将测出的基因序列用DNAStar的MegAlign软件与NCBI上相关TEM序列比对，构建系统进化树。

2 结果

2.1 分离培养结果

分离菌株经革兰氏染色镜检，可在视野内见到典型的或短或长的革兰氏阴性短杆菌（图1），经PCR鉴别试验得到的阳性菌株可在264 bp处得到目的条带（图2）。结果从肺脏、气管和心血中各培养出1株大肠杆菌，将3株大肠杆菌做ESBLs表型和基因分型测定。

图1 分离株的镜检结果（1 000×）

图2 分离株的PCR鉴定

2.2 药敏试验结果

纸片扩散法结果从3株大肠杆菌中筛选出心源性大肠杆菌为ESBLs菌株，将该菌株命名为HB01株。药敏结果显示该菌株对7大类17种药物均耐药，耐药谱为K+N+S+GM+OFX+ENR+CIP+TE+AMP+AMX+STX+FFC+CZ+CFP+EFT+CAZ+CTX，只对氨基糖甙类药物阿米卡星敏感。

2.3 PCR基因分型结果

对菌株HB01做ESBLs耐药基因分型试验，结果只扩增出1条与预期大小一致的TEM型ESBLs基因片段，而没有扩增出CTX-M、SHV、OXA型ESBLs基因片段（图3）。

图3 分离株TEM基因扩增

2.4 耐药基因序列对比结果

TEM耐药基因测序后，用BLAST在线比对以后，下载相关序列，其信息见表1。

表1 HB01株比对的相关序列信息统计

图4 HB01株的TEM基因系统进化树

如表1和图4所示，HB01株与GenBank上相关TEM基因同源性达99%，即该分离株与人类粪便和尿液、禽类肝脏和粪便、猪粪便、狗阴囊液及未使用过的导尿管等分离株的同源性均为99%，提示了该菌株的耐药基因可能在宠物、人、畜禽以及医用器材之间的转移和传播。该耐药基因与狗源最接近，提示应注意人畜共患病的危险。

3 讨论

随着抗菌药物选择性压力不断增大，以及兽医临床上抗菌药物的不规范使用，促进了携带ESBLs基因质粒的转移，致使ESBLs菌株检出率大幅提高，我国产ESBLs猪大肠杆菌的流行呈逐年上升趋势[6-10]。Yuan等研究表明产ESBLs菌的多重耐药程度显著高于非产ESBLs菌，流行的耐药基因以CTX-M和TEM基因型为主[11-15]。本试验所分离到的产ESBLs猪大肠杆菌耐药性很强，常用的7大类抗生素只对阿米卡星敏感，其耐药基因是TEM型，与国内众多学者研究结果一致。

本研究表明，该分离株的遗传基因与畜禽、人及宠物间同源性非常接近，这不得不引起科研工作者的重视。耐药基因在被污染的土壤、水源、畜禽之间和以及畜禽与人之间互相转移的现象，是否已呈流行趋势，这使得公共卫生面临严峻挑战。

细菌的耐药性可通过染色体或质粒介导在细菌间传播和扩散[16-17]，且耐药性增强导致的潜在危害能在动物和人之间交叉感染。Johnson等[18-19]在猫狗中检出与人相关的ST131表现出相似的耐药性和毒力因子。王影等[20]的研究发现，鸡源与人源大肠杆菌共同携带的耐药基因gyr B、sul2、TEM和flo R的同源性均高于97%。Thorsteinsdottir等[21]的研究也证实E.coli普遍存在的耐药性可以从动物传播到人，动物与人源大肠杆菌可能携带同一耐药基因，耐药基因可能在鸡源与人源大肠杆菌中水平传播，进而导致耐药性的传播，致使个别超级耐药菌株出现。

本试验进一步说明猪源ESBLs的耐药性相当普遍，耐受谱呈复杂和增大趋势。作为高热综合征的病原体之一，猪源ESBLs在公共卫生学上的重大意义，使我们不得不重视目前的耐药现状。临床和生产中应按照一定时间分离猪群ESBLs，并及时对其做药物敏感性试验，合理安排药物配伍，尽可能减少用药，降低ESBLs耐药性的产生和传播。

在目前的研究基础上，应更保守地使用现有抗生素，加强产酶耐药菌的监测和研究，以及通过投资激励研究人员精准研究、严格合理应用抗生素。此外，疫苗、噬菌体疗法和微生物组操纵等非抗生素的治疗方法，正受到日益广泛的关注。这些都可以有效防止产ESBLs大肠杆菌病的暴发和流行。