定远猪CATSPER1基因多态性及与产仔数的相关分析

李庆岗，田广友，吴义景，苏世广，许 娟

（1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031；2.定远县安康农牧有限公司，滁州 233200）

CATSPER离子通道蛋白是由Ren等（2001）首次发现的[1]，后来发现这个离子通道是一种复杂的蛋白质复合物，由至少6个亚单位，其中4个α亚单位（CATSPER 1-4）形成钙选择孔[2]，2个附加辅助子单元CATSPERB和CatSperG是跨膜蛋白，具有较大的细胞外结构域[3]。人和小鼠的研究表明，CATSPER家族主要表达于睾丸组织[4]，而猪CATSPER1基因的表达不仅仅限于睾丸组织，在猪附睾、下丘脑、子宫颈和子宫角都有表达[5-6]，因此CATSPER1除了对雄性个体精子运动和活力有关外[7]，可能对雌性的繁殖功能及生长性能有关。猪的CATSPER1基因位于2号染色体上，包含12个外显子，共编码722个氨基酸，本课题组在猪的重测序过程中发现该CATSPER1基因第一外显子存在1个错义突变，c.A779G（NM_001244257），该位点在 SNP 数据库中的编号为rs324850126，可导致第227位氨基酸H突变为R。因此，本研究以CATSPER1基因作为母猪繁殖性能的候选基因，研究定远猪母猪c.A779G位点多态性，并分析该位点多态性与初产母猪的产仔数相关性，以期寻找影响产仔数的主效位点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

定远猪猪群饲养在定远县安康农牧有限公司，统计2018年5—12月期间264头初产母猪的产仔数，并采集基础群264头母猪耳组织样品，迅速放入装有75%酒精的离心管中，送回实验室，并冷冻保存，用于提取基因组DNA。基因型分析于2019年2—3月完成。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 采用苯酚－氯仿抽提法，TE溶解，-20℃冷冻保存。

1.2.2 引物设计合成 根据CATSPER1基因DNA序列，应用Primer premier 5.0软件在多态位点（rs324850126）两侧，设计一对引物，突变位点可用限制性内切酶HhaI识别，由于该突变位点下游15 bp处仍有2个酶切位点，因此将下游引物进行了两处编辑（引物CATSPER1-R第15碱基由G改为T，第30位G碱基改为A），使HhaI只有突变位点一个识别位点，并在5'端增加了7个A，引物序列见表1。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 CATSPER1基因引物序列

1.2.3 PCR扩增 PCR反应体系均为（20 μL）：2×PCR Mix 10 μL，上游引物和下游引物各 0.5 μL，DNA模板 1 μL，加dd H2O至20 μL。PCR反应条件为：变性和延伸温度分别为95℃和72℃；退火温度为59℃，变性、退火、延伸时间均为30 s，35个循环；最后72℃延伸5 min。

1.2.4 限制性内切酶酶切（RFLP） CATSPER1基因可用限制性内切酶HhaI进行酶切。酶切反应体系均为 10 μL，其中内切酶 0.3 μL（3 U），10×Buffer 1 μL，PCR产物5 μL，加dd H2O至10 μL。反应温度均为37℃，酶切过夜。

1.2.5 统计分析

（1）基因效应估计如下[8]。

显性效应：d=AG-（AA+GG）/2；加性效应：a=（AA-GG）/2；显性度：D=d/a。

A 等位基因的平均效应：α1=q[a+d（q-p）]；G 等位基因的平均效应：α2=-p[a+d（q-p）]。

A等位基因替代G等位基因的平均效应值α=α1-α2=a+d（q-p）。

以上各式中，p为A等位基因频率，q为G等位基因频率，AA、AG、GG为各基因型对应性状的最小二乘均值。

（2）模型构建。

用于基因型效应分析的母猪初产繁殖性状包括总产仔数、产活仔数，采用PASW Statistics 18软件中的一般线性模型（GLM）对CATSPER1基因多态性与部分繁殖性状的相关性进行最小二乘分析，所用模型如下：

其中Y为性状观察值（总产仔数或产活仔数）；μ为群体均值；C为CATSPER1基因型效应；E为随机残差效应。

2 结果与分析

2.1 CATSPER1基因PCR扩增

CATSPER1基因PCR扩增见图1，PCR扩增后为226 bp单一条带，无杂带，可用于RFLP酶切。

图1 CATSPER1基因PCR扩增电泳

2.2 CATSPER1基因型判断

CATSPER1基因PCR扩增产物经HhaI限制性内切酶酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳，见图2，第1道为DL 2 000 Marker，酶切后会出现3条带，分别为226 bp、181 bp和45 bp，由于45 bp条带太短，无法通过琼脂糖凝胶进行检测，因此利用226 bp和181 bp两条带即可判断基因型。含有226 bp条带的个体为AA型，如图2中第13泳道；含有181 bp和45 bp（图中未显示）的个体为 GG型，如图2中2、3、5、6、10、11、12 泳道；同时出现 226 bp、181 bp 和 45 bp条带的个体为AG型，如图2中第4、7、8、9泳道。

图2 CATSPER1基因HhaI酶切电泳

2.3 CATSPER1在定远猪中的基因型和等位基因频率

CATSPER1基因在定远猪中的等位基因和基因型频率分布情况见表2。由表2可知，CATSPER1基因A 和 G 的等位基因频率分别为 0.166 7、0.833 3，3 种基因型AA、AG和GG的检测频率分别为0.030 3、0.272 7 和 0.697 0，而它们的期望频率分别为 0.027 8、0.277 8和0.694 4，基因型频率检测值和期望值经χ2适合性检验，差异不显著（P＞0.05），表明 CATSPER1基因在该群体中分布处于哈德-温伯格平衡状态。

表2 定远猪CATSPER1基因频率及基因型频率分布

2.4 CATSPER1对定远猪初产繁殖性状的效应分析

CATSPER1基因的AA型比AG、GG型个体的初产总产仔数分别高1.74、2.08头，均差异极显著（P＜0.01），AG 型个体总产仔数高于 GG 型个体，但差异不显著（P＞0.05）；AA 型个体初产活仔数比 AG、GG型个体分别高 1.61、1.66头，均达到显著水平（P＜0.05），而 AG 和 GG 型个体间差异不显著（P＞0.05），详见表3。CATSPER1基因对总产仔数、产活仔数表现出负的显性效应和正的加性效应；等位基因A对总产仔数、产活仔数具有正效应，分别为0.478和0.258；等位基因G对总产仔数和产活仔数具有负效应，分别为-0.096 和-0.052；该基因座上基因型对总产仔数和产活仔数的加性效应值分别为0.573和0.310，因此选择AA基因型个体的留种可提高群体的总产仔数和产活仔数，等位基因A为该群体的优良等位基因。

表3 CATSPER1基因多态性与产仔数相关及基因效应分析

3 讨论

定远猪是中国江淮流域优良的猪种之一，由于其生长速度慢、瘦肉率低、饲料报酬低，导致社会饲养量锐减。近几年，定远猪不断进行产业创新模式的探索，形成了规模化养殖和产业开发相结合，形成了从原种、祖代和父母代的繁育体系。繁殖性能好一直以来都是我国地方品种的优良特性，定远猪初产总产仔数 10.9～11.3 头，初产活仔数为 10.4～10.7头[8-9]，而本研究中统计分析了264窝未经选育的初产定远猪产仔情况，发现初产总产仔数为10.45头，产活仔数仅为9.65头。产仔数性状是微效多基因控制的复杂数量性状，遗传力低，通过表型选育，进展缓慢，因此开发更多的分子标记，根据标记进行选择显得尤为重要。CATSPER1基因是一种钙离子通道蛋白，不仅表达于公猪睾丸组织中，在下丘脑和母猪子宫颈、子宫角中也有表达，因此推广与母猪的繁殖性能可能存在一定的关系。本研究发现c.A779G位点在定远猪群体中存在多态性，并处于哈德-温伯格平衡状态，说明该群体对该位点未进行选择。多态性与产仔数间的相关分析表示，AA型个体总产仔数和产活仔数最高，AG型次之，GG型个体最少。AA型总产仔数均极显著高于AG和GG型（P＜0.01），AG和GG型个体间差异不显著（P＞0.05）；AA型产活仔数均显著高于 AG 和 GG 型（P＜0.05），AG 和GG型间差异不显著（P＞0.05）。等位基因A对定远猪总产仔数、产活仔数具有正效应，等位基因A替代G的效应值分别为0.573和0.310，因此等位基因A是定远猪的优良等位基因，AA型是定远猪的优良基因型。选择AA型个体留种可提高群体的产仔数，在今后选育中可适当提高等位基因A的频率。