黄芪、冬虫夏草对新生鼠肾积水病肾TGF-β1、IGF-1表达的影响

2019-06-18赵鹏马洪吴谋东刘红杨远贵鲁强董淑荃

贵州医药 2019年5期

赵鹏马洪吴谋东,3 刘红杨远贵鲁强董淑荃

(1.遵义医科大学附属医院小儿外科，贵州遵义 563003；2.贵州航天医院泌尿外科，贵州遵义 563000；3.贵州省人民医院，贵州贵阳 550002)

肾盂输尿管连接部梗阻(UPJO)所致肾积水是小儿泌尿系统常见的先天畸形之一。该病大多需手术解除梗阻，但新生儿肾积水特别是按胎儿泌尿外科(SFU)分级的0～Ⅱ级通常是不需要手术治疗的[1]。黄芪、冬虫夏草等对糖尿病肾病、肾小球肾炎等慢性肾病有保护作用[2-3]；因UPJO的肾损害也为一慢性过程，是否也有保护效应未见报道。为此，本研究以实验动物模型为切入点，应用黄芪、冬虫夏草进行干预，以探讨黄芪、冬虫夏草对先天性肾积水病肾损害有否保护作用，以期为临床更好地治疗该类病儿提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 SPF级成年Wistar雌鼠20只(体质量250±50 g)，雄鼠5只(体质量260±40 g)，由第三军医大学提供，许可证号：SCXK(渝)20120005。交配后所生48h内的新生Wistar鼠96只，随机分为8组，分别为假手术对照组、模型组、黄芪低剂量及高剂量组、冬虫夏草低剂量及高剂量组、联合用药低剂量及高剂量组，各12只。假手术组术中显露左输尿管后即关腹，作为对照组；余7组采用腰大肌压迫左输尿管上段，制作左输尿管不全梗阻的新生鼠肾积水动物模型[4]，再随机分为模型组及上述各干预组。对照组、模型组术后开始以生理盐水1.0 mL/kg/d皮下注射，干预各组：黄芪低剂量及高剂量组、冬虫夏草低剂量及高剂量组、联合用药(黄芪+冬虫夏草)低剂量及高剂量组，术后相应以1 mL/kg/d、3 mL/kg/d、0.5 mL/kg/d、2 mL/kg/d、(1 mL/kg/d+0.5 mL/kg/d)、(3 mL/kg/d+2 mL/kg/d)进行皮下注射。动物在饲养3周处死，游离并切取左侧肾脏，切取大小约0.5×0.4×0.3 cm3的病肾组织，置于4%的中性甲醛固定4～6 h，经脱水、浸蜡、包埋后，做病理学及免疫组化检测；另取约50 mg肾组织，剪碎置于去RNA酶的Eppendorf(EP)管中，加入1 mL RNA-Trizol，-80 ℃保存待检TGF-β1、IGF-1的基因表达。同时收集肾盂尿液、ELISA法检测尿TGF-β1、IGF-1水平。

1.1.2 主要试剂黄芪注射液购于黑龙江珍宝岛药业公司，冬虫夏草购于广东省中药局，冬虫夏草注射液：精密称取10 g天然虫草，粉碎置250 mL圆底烧瓶中加入50 mL蒸馏水回流煎煮3 h、过滤，反复3次，滤液浓缩至15 mL，-38 ℃真空冷冻干燥得提取物，用0.9%NS配制相应浓度[5]。RNAiso Plus(Trizol液)、TGF-β1mRNA及IGF-1mRNA引物、Prime ScriptTMRT、SYBR®Premix Ex TaqTMIID购于大连宝生物工程有限公司；兔抗鼠TGF-β1、IGF-1 一抗，山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；鼠TGF-β1、IGF-1酶联免疫分析盒购于美国R&D公司。

1.2 实验方法

1.2.1 病肾组织结构的变化切片常规脱蜡至水，苏木素5 min→水洗→盐酸酒精分化数秒→水洗→伊红液染色30 s →水洗→酒精脱水→二甲苯透明→中性树胶封片→光镜下观察。

1.2.2 免疫组化检测病肾组织TGF-β1、IGF-1的表达切片脱蜡至水，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶10 min，pH=6.0的0.01 M柠檬酸盐高压锅抗原修复2.5 min，采用PV-6001法检测病肾组织内TGF-β1、IGF-1的表达。结果判定：在光镜下观察各组免疫组化切片TGF-β1、IGF-1表达情况，出现棕黄色颗粒为阳性。在400倍视野下，每张切片随机选取5个互不重叠区域，应用Image-ProPlus(Version6.0)图像分析软件(IPP6.0)进行图像分析，并测每一图像阳性细胞的光密度(OD)，计算平均值。

1.2.3 RT-PCR法检测病肾组织TGF-β1mRNA、IGF-1mRNA的表达变化 QPCR反应。TGF-β1的上游引物：5′TGGAGCCTGGACACACAGTA3下游引物：5’CGTAGTAGACGATGGGCAGTG3’扩增长度：82 bp；IGF-1的上游引物：5’TGGCACTCTGCTTGC TCAC3’下游引物：5’GGTCCACACACGAACTGAAG3’扩增长度：140 bp，以管家基因β-actin做内参进行校正，计算TGF-β1、IGF-1的相对表达量。

1.2.4 ELISA法检测尿TGF-β1、IGF-1的水平鼠TGF-β1、IGF-1酶联免疫试剂盒做ELISA反应，用ELX-800型酶标仪检测OD450值。

2 结果

2.1 实验动物存活在新生鼠肾积水动物模型制作实验期间，新生鼠96只中死亡5只，其中麻醉过深致死1只、术中死亡2只(包括肾动脉断裂死亡1只)，术后饲养期间腹腔感染死亡2只；存活91只，存活率94.79%(91/96)。表明符合实验动物模型的制作。

2.2 病理学检查大体观：对照组双肾等大、无积水，肾实质质地一致；模型组病肾较健肾大，包膜紧张，颜色苍白，肾实质菲薄，肾盂扩张、积水；干预各组病肾虽仍较健肾大，但肾盂扩张、积水较模型组轻(见图1)。梗阻近端输尿管扩张、增粗，合并积水。镜下观：对照组双肾肾小球、肾小管发育正常；模型组病肾肾小球形态怪异、失常，肾小囊、肾小管明显扩张，肾间质纤维化重，伴不同程度炎症反应；干预各组的病理改变较模型组轻(图2)，随药物剂量增大、以及联合用药，病肾组织结构的损害逐渐减轻。

注：1A.对照组；1B.模型组；1C.干预组。

图1 实验动物左肾组织结构变化

2.3 病肾组织内TGF-β1、IGF-1蛋白及基因的表达对照组肾组织TGF-β1低表达、IGF-1高表达(图3A-B)，模型组病肾组织TGF-β1高表达、IGF-1低表达，以肾小管胞浆内出现棕褐色颗粒为阳性(图3C-D)。干预各组TGF-β1、IGF-1均有不同程度表达(图3E-F)。应用Image-ProPlus图像分析软件测量的光密度值及RT-PCR检测TGF-β1mRNA、IGF-1mRNA见表1。对照组肾组织内TGF-β1、IGF-1光密度及其mRNA与相应模型组、干预各组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，但干预各组病肾损害较模型组明显减轻；黄芪、冬虫夏草干预各组的低剂量与高剂量组间比较，差异也有统计学意义(P<0.05)，其中联合用药组优于单一用药组。表明黄芪、冬虫夏草可调控新生鼠病肾组织TGF-β1、IGF-1蛋白及基因的表达，以减轻或阻止病肾的肾损害。

注：A.对照组TGF-β1，肾小管上皮细胞弱阳性表达；B.对照组IGF-1，肾小管上皮细胞强阳性表达；C.模型组TGF-β1，左肾肾小管上皮细胞强阳性表达；D.模型组IGF-1，左肾肾小管上皮细胞弱阳性表达；E.干预组TGF-β1，左肾肾小管上皮细胞不同表达；F.干预组IGF-1，左肾肾小管上皮细胞不同表达。

图3 实验动物肾组织内TGF-β、IGF-1的表达

注：模型组、干预各组与对照组比较，*P<0.05；干预各组的低剂量组与高剂量组间比较，△P<0.05。

2.4 病肾尿TGF-β1、IGF-1的水平 ELISA法检测病肾尿TGF-β1、IGF-1水平见表2。对照组尿TGF-β1水平低、IGF-1水平高，模型组病肾尿TGF-β1水平升高、IGF-1水平降低；干预各组尿TGF-β1、IGF-1水平介于对照组与模型组之间。对照组尿TGF-β1、IGF-1水平与相应模型组、干预各组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；黄芪、冬虫夏草干预各组的低剂量与高剂量组间比较，差异也有统计学意义(P<0.05)。

表2 实验各组病肾肾盂尿内TGF-β1、IGF-1水平

注：模型组、干预各组与对照组比较，*P<0.05；干预各组的低剂量组与高剂量组间比较，△P<0.05。

3 讨论

近年来，随着围生期胎儿B超的广泛普及应用，胎儿肾积水的检出率逐年增多。胎儿出生后在B超的严密监测下，一些无症状、隐匿性新生儿肾积水，按1988年美国胎儿泌尿外科学会(SFU)对胎儿肾积水及新生儿肾积水的分级，其中0～Ⅱ级通常是不需要手术治疗的，但需严密观察，一旦病肾的分肾功能GFR(肾小球滤过率)降至15%以下，则需要手术及时干预[6]。

中成药黄芪具有补气升阳、益气健脾、扶正固本以及利水消肿、补中益气之功效[7]，它对高血压肾病、糖尿病肾病等慢性肾脏疾病肾损害方面是有保护作用的[8]；相关研究表明中药冬虫夏草对慢性肾炎、肾衰竭等肾脏疾病的肾损害也具有保护作用[9]。为此，本实验以动物模型为切入点，应用黄芪、冬虫夏草对先天性肾积水动物模型进行皮下注射，以期观察对先天性肾积水病肾损害有否保护作用。

本研究结果表明，黄芪、冬虫夏草干预各组的病理改变较模型组轻，且随药物剂量增大、以及联合用药，病肾组织结构的损害逐渐减轻。说明黄芪、冬虫夏草对先天性肾积水病肾损害具有一定的保护效应。

TGF-β1是多种细胞产生的一种致纤维化因子，其可增加细胞外基质(ECM)的合成、减少ECM的降解，具有抑制细胞的有丝分裂，促进细胞间质纤维化的生物学作用[10-13]。在慢性肾病如糖尿病肾病中，TGF-β1与其相应的受体(TGF-β1R I-Ⅲ)结合后，通过Smad蛋白在细胞核内大量转录、复制，促进ECM大量聚集，导致肾间质纤维化，以及引起肾小管上皮的损伤[14-16]。然而在肾脏中广泛存在的IGF-1，其合成受生长激素(GH)、胰岛素水平等的调节，应用IGF-1可减轻肾脏纤维化和肾小管的扩张等作用[17]。本研究发现，模型组病肾组织TGF-β1在肾小管上皮细胞表达升高、IGF-1表达降低，这与Seseke F等，马洪等的结果一致[18-19]。分析原因可能是新生鼠肾积水病肾组织肾小管上皮细胞分泌TGF-β1、通过TGF-β/Smad信号通路细胞膜上TGF-β1受体进入细胞内大量转录、翻译，致使病肾组织TGF-β1高表达，从而加速肾间质纤维化，导致病肾损害，致使病肾IGF-1分泌降低，IGF-1 呈低表达。应用黄芪、冬虫夏草对UPJO新生鼠模型皮下注射后，病肾组织TGF-β1表达减低、IGF-1表达升高，肾间质纤维化减轻，且高剂量组、联合用药组明显优于低剂量组及单一用药组。究其原因可能是黄芪、冬虫夏草阻碍TGF-β/Smad信号通路传导，下调病肾组织TGF-β1的表达，阻止被磷酸化后的TGF-β1R I与Smad结合，抑制ECM的生成，降解肾脏纤维化的发生，减轻肾间质纤维化。此外，病肾也可能通过调节IGF-1活性的特殊蛋白(IGFBPs)之种类和数量，增强IGF-1启动细胞传导通路，激活IGF-1基因的正向表达，从而对病肾损害起到一定的保护作用。应用ELISA法检测病肾尿TGF-β1、IGF-1水平表明：干预各组病肾尿TGF-β1、IGF-1水平介于对照组与模型组之间，这进一步证实黄芪、冬虫夏草通过调控新生鼠病肾组织TGF-β1、IGF-1蛋白及转录水平的变化，对病肾尿也产生相似的影响。由此可见，黄芪、冬虫夏草能在一定程度上阻止或降低病肾功能的损害，对先天性肾积水可能通过下调TGF-β1或/和上调IGF-1的表达，从而对UPJO病肾损害产生一定的保护效应。