首发儿童精神分裂症患者脑源性神经营养因子水平及神经元凋亡研究

杨 俊，佟 靓，周立国*

(1.大理州第二人民医院，云南 大理 671000；2.云南省精神病医院，云南 昆明 650101

儿童精神分裂症具有起病年龄小、易反复发作、治疗难度大、预后差的特点，严重影响患者身心健康[1]。精神分裂症的病因学研究指出，神经发育障碍是精神分裂症发病的重要影响因素。精神分裂症患者存在脑室扩大、脑沟变宽、海马体积缩小、脑体积减小等颅脑异常[2]。Sporn等[3]研究显示，儿童精神分裂症患者的脑灰质和脑体积较健康儿童小，且其脑灰质密度降低早于精神分裂症的症状出现，精神分裂症患者的脑发育异常在胎儿期就已出现，主要表现为脑室扩大，这种病理改变贯穿于童年期[4]。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经发生蛋白，是神经可塑性的重要调节因子[5-6]，BDNF表达减少可引起内嗅皮质、额叶皮质、海马和扣带回细胞结构紊乱，破坏神经元的交互对话，导致颅脑发育异常[7]，BDNF对神经元的生物学作用提示其可能是精神分裂症发病的影响因素。β Ⅲ型微管蛋白(β-Ⅲ-tubulin，Tuj-1)是一种参与神经元细胞类型特异性分化的微管蛋白，在神经元突触分化时表达增加，参与神经元的交互对话[8]。当神经元受损、突触分化障碍时，Tuj-1表达水平降低，Tuj-1可作为神经元突触分化的特异性标志物[9]。在细胞凋亡进程中，胱天蛋白酶3(Caspase-3)被激活提示细胞凋亡已进入不可逆阶段，有研究指出，Caspase-3作为神经元凋亡相关指标在神经元轻微损伤时表达就会增加[10]。基于精神分裂症的颅脑病变特点及BDNF对神经元的调节作用，本研究探索BDNF、神经元标志物Tuj-1和凋亡标志物Caspase-3在儿童精神分裂症中的变化，为揭示儿童精神分裂症的病因和发病机制提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象

以2015年8月-2018年3月在大理州第二人民医院就诊的儿童精神分裂症患者为研究组。纳入标准：①符合《精神障碍诊断与统计手册(第4版)》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，fourth edition，DSM-IV)精神分裂症诊断标准；②年龄3～12岁；③既往未经任何治疗的首发患儿，无系统精神类药物应用史；④汉族；⑤无心、肝、肾等器质性疾病。排除标准：①合并脑炎、癫痫、多发性硬化、精神发育迟滞等神经系统器质性疾病者；②有颅脑外伤病史者。符合纳入标准且不符合排除标准共35例。同期采用计算机随机法从在大理州第二人民医院体检的儿童中选取30例年龄、性别、受教育程度与研究组匹配的健康儿童为对照组。纳入标准：①年龄3～12岁；②汉族；③无心、肝、肾等器质性疾病。排除标准：①合并脑炎、癫痫、多发性硬化、精神发育迟滞等神经系统器质性疾病者；②有颅脑外伤病史者；③二系三代有精神病家族史或自杀史者。本研究经大理州第二人民医院伦理委员会审核批准。研究对象均由其监护人签署知情同意书。

1.2 BDNF、Caspase-3和Tuj-1的mRNA检测

所有儿童于入组当日08∶00-10∶00由护士抽取空腹静脉血5 mL置于抗凝管中作为标本。用Trizol裂解液提取总RNA后于-80℃保存，将总RNA逆转录为cDNA，再进一步进行cDNA扩增。

使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。逆转录体系50 uL：5×PrimeScript Buffer 10 μL，Oligo(dT) primer (50 μM) 2.5 μL，Prime Script RT Enzyme MixI 2.5 μL，Random 6 mers(100 uM)2.5 μL，Total RNA 2.5 μL，RNase Free ddH2O 30 μL。RNA逆转录条件：① 37℃，15 min，然后进行；②85℃，5 s，最后进行；③4℃，forever。在cDNA中加入引物后进行扩增，RT-PCR反应体系20 μL：cDNA 1 μL，Primer1 0.5 μL，Primer2 0.5 μL，Mix 10 μL，RNase Free ddH2O 8 μL。RT-PCR顺序反应条件：①50℃，2 min，②95℃，2 min，③95℃ 15s，60℃ 1min 该步骤进行40个循环，④95℃，15 s，⑤60℃，30 s，⑥ 95℃，15 s。每个样本做3个重复。BDNF、Caspase-3、Tuj-1基因引物由美国英杰(Invitrogen)生物公司合成。BDNF：上游引物：5′-CAGAGGAGCCAGCCCGGTGCG-3′，下游引物：5′-CTCCTGCACCAAGCCCCATTC-3′。Caspase-3：上游引物：5'-ACCGATGTCGATGCAGCTAA-3'；下游引物：5'-GGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3'。GAPDH：上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；下游引物：5'-TTGGCTCCACCCTTCAAGTG-3'。Tuj-1：上游引物：5'-CCATCTAGCTACTGACACTG-3'；下游引物：5'-AAGTGGACTCACATGGAGTG-3'。本研究所有实验均重复3次。

1.3 设备与试剂

Trizol裂解液购买于美国西格玛(Sigma)生物公司。逆转录试剂盒购买于日本他卡若生物公司。PCR扩增仪购于美国伯乐公司，型号Tetrad2。RT-PCR系统购于美国应用生物系统公司，型号7300。

1.4 统计方法

2 结 果

2.1 两组一般资料比较

研究组年龄(8.31±2.16)岁；男生18例，女生17例；小学19例，学龄前16例。对照组年龄(9.02±1.76)岁；男生15例，女生15例；小学16例，学龄前14例。

2.2 两组BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表达水平比较

研究组BDNF mRNA和Tuj-1 mRNA表达水平均低于对照组，Caspase-3 mRNA表达水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05或0.01)。见表1、图1。

表1 两组BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表达比较

图1 两组BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表达比较

3 讨 论

儿童精神分裂症是较常见的儿童精神疾病，与神经发育异常关系密切。精神分裂症与神经元的变性、凋亡密切相关，其特异性症状、认知缺陷的持续进展及治疗效果较差可能与神经细胞的功能下降有关。儿童及青少年阶段是神经细胞快速增殖、生长时期，这一时期神经细胞发生大量凋亡必将影响儿童的脑组织生长和发育，从而导致一系列神经及精神问题。

本研究显示，儿童精神分裂症患者Tuj-1表达较健康儿童低。Tuj-1是一种微管蛋白，是神经元的特异性抗原之一。研究显示[11-12]，在大脑发育过程中，神经干细胞分化为神经元是一个循序渐进的过程，分别经历了神经干细胞、神经祖细胞、神经母细胞、不成熟神经元和成熟神经元阶段。在此过程中，Tuj-1的表达增加提示神经元正处于发展和成熟的过程，Tuj-1表达减低提示神经元减少[13]。本研究中患儿Tuj-1表达降低，提示精神分裂症患儿脑内神经元减少、受损或死亡。

Caspase-3是细胞凋亡下游的关键执行者之一，其表达上调提示凋亡蛋白表达增加，即凋亡的细胞数量增加。本研究显示，精神分裂症患儿Caspase-3表达较健康儿童高，提示精神分裂症患儿脑内凋亡的神经元数量较正常儿童多。

本研究中，研究组BDNF mRNA表达低于对照组，推测BDNF表达减少后神经元失去相应滋养，从而导致神经元凋亡，产生功能缺损，表现出精神分裂症的一系列症状。神经营养因子在神经元的发生、发育、成熟及凋亡过程中均发挥重要调节作用，对中枢和外周神经元的存活起到支撑作用[14-15]。BDNF表达于大脑皮层、海马、纹状体等与精神分裂症发病相关的脑区，对新神经元的发生、发育和存活具有调控作用，对发育成熟神经元的功能维持具有保护作用[16-17]，BDNF表达降低会产生一系列颅脑发育异常及神经精神障碍[18]。本研究结果显示，精神分裂症患儿BDNF表达减少，与既往研究结果一致。

综上所述，儿童精神分裂症患者BDNF mRNA和Tuj-1mRNA表达减少，Caspase-3 mRNA表达增加，推测BDNF、Tuj-1和Caspase-3可能与儿童精神分裂症的发病相关。本研究的局限性在于：仅观察35例首发精神分裂症患儿的BDNF、Tuj-1及Caspase-3的mRNA表达变化，且未对mRNA转录的蛋白质进行研究，在今后的研究中应扩大样本量，同时对相关转录因子及转录后蛋白进行研究，并进一步探讨BDNF表达减少、神经元凋亡后神经元的功能及交互对话，以揭示儿童精神分裂症的病因和发病机制。