花生NRT1基因对盐胁迫的响应

孔伟伟田丽彬李荣冲肖丽娜崔 凤刘译阳李国卫*万书波*

(1.山东师范大学生命科学学院,山东 济南 250014; 2.山东省农业科学院生物技术研究中心,山东 济南 250100)

花生在我国种植广泛,是重要的油料作物和经济作物,出油率高达45%～50%,与其他油料作物相比优势明显[1]。花生属于豆科植物,除了通过根系吸收土壤中的氮素,根瘤菌固氮也是氮素利用的一种重要方式。氮元素是构成生物的主要元素之一,在植物体内参与蛋白质、核酸、叶绿素等生物大分子的合成,影响植物的生长和果实的发育,对作物产量和品质的影响较大[2]。铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)是作物吸收利用的主要氮素形态,其中硝态氮是旱地作物吸收利用的主要氮源。硝态氮的吸收主要由低亲和硝酸盐转运蛋白(NRT1)和高亲和硝酸盐转运蛋白(NRT2)完成[3]。因此,研究硝酸盐转运蛋白的功能及其在植物氮素吸收和转运中的作用非常必要。

硝酸盐转运蛋白1(NRT1)家族是植物中最大的硝酸盐转运蛋白家族[4]。迄今为止,在拟南芥中已经发现了11个低亲和硝酸盐转运蛋白,分别为AtNRT1.1～AtNRT1.9,AtNRT1.11和AtNRT1.12[5],其中AtNRT1.1是第一个被发现和定位的低亲和硝酸盐转运蛋白[6]。因此,利用生物信息学综合分析NRT1基因家族特征,并研究其对盐胁迫的响应,可以为深入研究花生NRT1基因的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物培养及盐处理

供试花生品种为Tifrunner,种子置于沙土中萌发7～8 d,待下胚轴将子叶完全顶出沙土且长出真叶时,将幼苗移出,用自来水将根部沙子冲洗干净,移到盛有2L Hoagland培养液的水培盒中进行水培,每盒4株幼苗。在18 d苗龄时选生长基本一致的植株进行梯度盐胁迫处理。

盐处理浓度梯度分别为:0、100、150、200、250和300 mmol/L NaCl。每个浓度处理设3次重复,盐胁迫处理时间为4 d。

1.2 叶片硝酸盐含量的测定

花生幼苗盐胁迫处理4 d后,将完整植株从水培盒中取出,用蒸馏水将表面冲洗干净,吸水纸吸干表面的水分,取整株的叶片,用锡箔纸包好,置于80℃烘干至恒质量。还原法测定硝酸盐含量[7]。

1.3 基因检索

在TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/)中检索获得拟南芥NRT1的蛋白序列,并用拟南芥NRT1的蛋白序列在花生基因组数据库Peanutbase(https://peanutbase.org/)中运行Blastp程序,以满足E-value＜e-100的标准筛选出Pfam00854的目标蛋白序列,以FASTA格式进行保存。

1.4 生物信息学分析

将花生NRT1与拟南芥NRT1蛋白序列比对分析,利用Mega5.2软件进行进化树构建。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)软件分析跨膜结构域。利用花生转录组数据(NCBI: PRJNA354652),查找NRT1基因家族,并使用Cuffdiff软件计算花生22个不同组织的表达量(FPKM值)[8],利用HemI软件进行表达模式分析。利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在线软件分析基因结构。

1.5 基因表达分析

RNA提取、文库构建、高通量测序及差异基因分析参照Cui等[9]方法。将培养18 d的花生幼苗用250 mmol/L NaCl胁迫处理 4 d后,将根和叶片分别取样,利用RNAiso Reagent试剂盒提取RNA,利用DNase I去除基因组DNA污染。RNA质量检测、建库,利用华大基因(BGI)的Illumina HiSeq 2000 平台进行测序,每组样品设3次生物学重复。用NOISeq法筛选3个生物样品间的差异表达基因,标准为:|log2ratio|≥1,p值≥0.8。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对花生叶片硝酸盐积累的影响

图1 不同浓度盐胁迫条件下花生叶片硝酸盐含量Fig.1 Nitrate content in peanut leaf under various salt stress

花生属中等耐盐植物,盐胁迫明显抑制花生的生长发育,盐胁迫浓度越高越明显。当培养液中盐胁迫浓度大于200 mmol/L时植株出现萎蔫现象。硝酸盐含量测定结果显示,叶片硝酸盐含量随盐浓度升高逐渐降低。在100～300 mmol/L处理浓度下,叶片内硝酸盐含量分别比对照降低了31.4%、48.9%、74.8%、79.1%和81.8%(图1)。

2.2 花生NRT1基因鉴定与系统进化分析

在花生数据库进行NRT1基因检索,共发现37个同源基因(表1)。这些基因不均匀地分布在A和B基因组中,分布在除B04和B08外的18条染色体的不同位置上。其中A基因组中有18个基因,A01上有4个,A03上有3个,A02、A05和A07上各有2个,A04、A06、A08、A09和A10上各有1个;B基因组中有19个基因,B01上有4个,B02、B03和B07上各有3个,B05和B06上各有2个,B09和B10上各有1个。这些基因被重命名为AhNRT1.1～AhNRT1.37。

表1 花生NRT1基因家族生物信息学分析Table 1 Bioinformatics analysis of NRT1 family in peanut

图2 花生NRT1家族进化树Fig.2 The phylogenetic analysis of the NRT1 family in peanut

对这些蛋白的跨膜区分析发现,37个花生NRT1蛋白都含多个跨膜区,一条蛋白序列上跨膜区数目最多21个,最少8个。其中含10～12个跨膜区的蛋白数目最多 (表1)。

为揭示花生NRT1家族37个成员的系统进化关系,并对其进行分类,利用11个拟南芥NRT1家族成员的蛋白全长序列构建系统进化树(图2)。基于拟南芥NRT1家族的分类情况,花生NRT1家族的37个成员形成A～F6个亚家族。A和D亚家族中分别只有2个和12个花生NRT1,而没有拟南芥NRT1。B亚家族中仅有1个花生NRT1家族成员AhNRT1.30;C亚家族中10个花生NRT1家族成员与拟南芥AtNRT1.5和AtNRT1.8亲缘较近,并且分支较多,说明该分支进化较快,在进化中产生较多变异;E和F亚家族中各有6个花生NRT1。同源性高的基因在功能上具有更高的相似性,花生与拟南芥中相近的NRT1蛋白可能具有相同或相似的功能。

2.3 花生NRT1基因结构分析

37个花生NRT1基因结构分析发现,他们具有明显不同特点(图3)。AhNRT1.7、AhNRT1.9、AhNRT1.21、AhNRT1.26和AhNRT1.28含有6个以上外显子,且碱基数目也较多,说明这5个基因可能发生外显子增多的变异,从而导致基因长度也随之增长。7个基因具有5个外显子,22个基因具有4个外显子,AhNRT1.1、AhNRT1.3和AhNRT1.20只有2～3个外显子。

图3 花生NRT1家族基因结构Fig.3 Gene structure of NRT1s in peanut

图4 花生NRT1基因组织特异性表达分析Fig.4 Tissue-specific expression of NRT1 family in peanut

2.4 花生NRT1基因组织表达分析

转录组数据分析发现,花生中37个NRT1基因在22个不同组织的表达量具有明显的组织特异性(图4)。AhNRT1.9和AhNRT1.28两个基因在花生22个组织均有表达,推测这两个基因可能参与不同组织氮素的吸收与转运;AhNRT1.12在花生根瘤中表达量较高,表明其可能参与根瘤中氮素的吸收转运;另外还有部分基因分别在花生的茎、叶、花、果荚以及种子处有较高表达。说明花生NRT1的表达具有时间和空间特异性,并可能在花生不同发育时期和不同组织中参与氮素吸收转运。

2.5 花生NRT1家族基因对盐胁迫的响应

盐胁迫处理后花生叶片中硝酸盐的积累显著降低,可能与硝酸盐吸收、转运能力下降有关。通过对表达谱数据的分析发现,在栽培花生品种Tifrunner中发现9个对盐胁迫响应的NRT1基因,根和叶片中分别有8个和6个NRT1基因表达受盐胁迫调控。其中,根中AhNRT1.3和AhNRT1.10分别上升10.57倍和11.59倍;AhNRT1.10在叶片中上调最明显,表达上升高达674.9倍。AhNRT1.18在根和叶片中的表达均受盐胁迫抑制,而AhNRT1.10、AhNRT1.24和AhNRT1.30在根和叶片中的表达均受盐胁迫诱导 (图5)。

图5 花生NRT1盐处理后相对表达量Fig.5 The relative expression of peanut NRT1s after salt stress

3 讨 论

硝酸盐是高等植物的主要氮源[10],大部分植物从土壤获得的硝酸盐通过硝酸盐转运蛋白(NRT)进行转运[11]。NRT1是植物中硝酸盐转运的关键转运蛋白家族,其功能研究一直备受关注。拟南芥等植物中NRT1家族研究已经较明确,而花生中NRT1研究相对较少。本研究对花生NRT1基因家族进行进化分析发现,37个花生NRT1按亲缘关系远近分成6类。基因结构和跨膜区分析表明,6个亚族具有不同的跨膜区和外显子数目,说明不同分支间DNA和蛋白序列差异比较大。

NRT1家族成员较大决定了其功能的多样性及调控的复杂性。表达模式分析表明花生NRT1在花生22个组织中的表达具有明显的组织特异性。B和C亚族基因与拟南芥中的AtNRT1.5,AtNRT1.8和AtNRT1.9亲缘关系更近(图2),说明花生中这些可能共同参与将根部吸收的硝酸盐转运到地上部[12]。大豆中的NRT1.2在根及根瘤中表达量较高,推测其参与根瘤菌共生固氮过程中氮素的转运[13]。本研究发现AhNRT1.12在花生根瘤表达量最高,可能是参与根瘤固氮和氮素吸收转运的主要蛋白。正常条件下花生NRT1基因在花生茎、叶、花、果荚以及种子处的表达量不同,这可能与不同组织中硝酸盐转运的时空特异性有关。

NRT1可能参与逆境胁迫条件下植物硝酸盐吸收与转运调控。盐胁迫条件下,花生中AhNRT1.3,AhNRT1.9,AhNRT1.11和AhNRT1.18等基因表达在根或叶片中下调可能是叶片中硝酸盐积累下降的原因,同时硝酸盐积累的下降也可能是植物生长受抑制的原因之一。而AhNRT1.3,AhNRT1.8,AhNRT1.10,AhNRT1.20,AhNRT1.24和AhNRT1.30等基因在盐胁迫条件下表达增加可能有利于维持根或叶片中硝酸盐的吸收和转运。研究发现甘蓝型油菜NRT1.5和NRT1.8受低氮及重金属镉胁迫的诱导[14],说明NRT1也可能参与植物适应其他类型逆境胁迫的调控。