CRKP碳青霉烯酶基因检测及同源性分析

陈 娅，邱隆敏

(遵义医科大学附属医院 1. 感染科； 2. 感染管理科，贵州 遵义 563003)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KPN)是革兰阴性(G-)杆菌，需氧或兼性厌氧，属于机会性病原体，广泛分布于医院的各种环境中，可引起患者多种组织器官的感染，常见的有血液系统、呼吸系统、泌尿系统等。β-内酰胺类抗生素中，抗菌活性最强、抗菌谱最广的是碳青霉烯类抗生素，因其只对细菌有杀伤作用，故对宿主毒性小，对头孢菌素酶(AmpC酶)及超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)作用效果稳固，是治疗大多数革兰阳性(G+)菌、G-菌及耐药菌感染的极佳药物。但近年来，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)的检出率逐步攀升，并已在全球多个国家散发和(或)流行[1-2]。CRKP的耐药机制极其复杂，结合各个国家和地区的研究报道[3-4]，主要包括以下四个方面：(1)产碳青霉烯酶；(2)高产AmpC酶或ESBLs，且外膜孔蛋白(outer membrane porin,OMP)缺失或者OMP表达量减少；(3)青霉素结合位点缺失；(4)外排泵系统作用等，其中以产碳青霉烯酶最常见和重要。本研究收集2017年1—12月某大型三甲医院分离自临床各科室的CRKP，检测碳青霉烯酶基因，并进行同源性分析，发现该院2017年存在ST11型和ST875型CRKP的克隆流行，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集某三甲医院2017年1—12月临床各科室分离的CRKP 22株。菌株入选标准：(1)为CRKP；(2)少数患者住院期间多次培养出CRKP，则纳入该患者首次培养的CRKP；(3)CRKP感染患者住院资料完整。质控菌株为大肠杆菌ATCC 25922(购于大连宝公司)，阳性对照菌为该院2016年发现的并经测序确证的产KPC-2型CRKP和产NDM-1型CRKP。

1.2 主要仪器和试剂 VITEK 2 Compact分析系统(生物梅里埃公司)，高速离心机(德国Sigma公司)，PCR扩增仪、PowerPac Basic电泳仪、GelDocXR凝胶成像系统均为美国伯乐Bio-Rad公司产品，厄他培南(ETP)、亚胺培南(IPM)及美罗培南(MEM)三种10 μg/片的药敏纸片均为Oxoid公司产品，IPM粉剂及ETP粉剂购自杭州默沙东公司，MEM粉剂购自深圳市海滨公司，细菌蛋白提取试剂盒、M-H培养基、酚红、EDTA、琼脂糖Agarose、硼酸、Tris碱、GoldView I型核酸染色剂均为北京索来宝产品，ZnSO4·7H2O(上海拜力公司)，引物合成(上海生工)，2×Taq PCR Master Mix(北京派拓公司)，DNA Marker(2 000 bp)(宝日医公司)等。

1.3 试验方法

1.3.1 药敏试验 试验结果判断参照2018版美国临床实验室标准化协会标准(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)[5]。

1.3.1.1 药敏纸片扩散法(K-B法) 采用K-B法测定菌株对IPM、MEM及ETP三种药敏纸片的抑菌圈直径。

1.3.1.2 微量肉汤稀释法 通过微量肉汤稀释法测定菌株对IPM、MEM和ETP的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)。

1.3.2 碳青霉烯酶检测

1.3.2.1 改良Hodge试验(modified Hodge testing,MHT) 取适量大肠埃希菌ATCC 25922的菌落置于生理盐水中，用比浊仪配制为0.5麦氏单位，1∶10稀释后分别均匀涂布于3个M-H琼脂平板，干燥3～10 min后，3个平板中央分别贴IPM、MEM及ETP药敏纸片，从平板边缘向纸片边缘依次划线接种待测菌株、阳性对照及阴性对照菌，直线至少长20～25 mm，需氧(35±2)℃培养16～20 h后观察结果。判断标准：待测菌株若产生碳青霉烯酶(MHT阳性)，则大肠埃希菌ATCC 25922的抑菌环周边和待测菌株接种线交汇处有菌株增强生长的情况，呈苹果蒂现象。

1.3.2.2 Carba NP试验 Carba NP A液为取2 mL 0.5%的酚红溶液加入到16.6 mL的实验室试剂用水中，再加入180 μL 10 mmol/L的ZnSO4溶液，使每毫升的5 g/L酚红中含0.1 mmol/L的ZnSO4,使将A液pH值调至7.8±0.1，Carba NP B液为A液+6 mg/mL亚胺培南，A、B液的颜色均为红色或橘红色。分别在2支离心管(a管、b管)中加入100 μL细菌蛋白提取试剂，2支管中分别加入1～2个菌落的待测菌(空白对照组只含细菌蛋白提取试剂，不含待测菌)，涡旋振摇5 s后在a管中加入100 μL A液，b管中加入100 μL B液，将a管和b管均置入(35±2)℃的恒温培养箱中培养2 h，每30 min观察一次溶液颜色是否变化。判断结果参照2018版CLSI标准[5]。

1.3.3 PCR扩增耐药基因 运用煮沸法提取菌株DNA模板，PCR扩增以下耐药基因：KPC、SME、IMI、NDM-1、IMP、SIM、VIM、OXA-48，引物序列参照相关文献[6-8]，由上海生工公司合成。扩增体系为25 μL体积，包括2×PCR Master Mix 12.5 μL、DNA模板2 μL、100 μmol/L上游引物0.1 μL、100 μmol/L下游引物0.1 μL、加PCR超纯水至25 μL。PCR扩增条件：94℃ 3 min预变性，94℃ 30 s变性，退火温度(KPC、SME、IMI、NDM-1、IMP、SIM、VIM、OXA-48 59、45、47、58、50、53、54、56℃) 30 s退火，72℃ 1 min延伸，35个循环，72℃ 10 min再延伸。取5 μL的PCR产物加入1.2%的琼脂糖凝胶孔中，在0.5×TBE电泳液中电泳， 在凝胶成像系统中观察结果。将PCR扩增阳性的产物送上海生工纯化并测序，测序结果用MegAlign软件与基因库中的序列进行比对。

1.3.4 同源性分析

1.3.4.1 多位点序列分型 (multilocus sequence typing,MLST) 参照MLST官方网站 (http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html) 上提供的KPN的7个管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)序列合成引物，扩增体系同1.3.3，扩增条件为94℃ 5 min预变性，94℃ 50 s变性，50℃ 30 s退火，72℃ 50 s延伸，30个循环，72℃ 10 min再延伸。PCR产物送上海生工公司测序，将测序结果与MLST数据库比对，得到等位基因编码，将所得编码按照gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB管家基因顺序组合，在MLST数据库中对比查找完全符合的ST型。

1.3.4.2 肠杆菌科基因间一致重复序列PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR, ERIC-PCR) 基因引物序列为：ERIC-1: 5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’；ERIC-2: 5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。扩增体系同1.3.3，扩增条件为94℃ 3 min 预变性，94℃ 30 s变性，55℃ 30 s退火，72℃ 1 min延伸，35个循环，72℃ 10 min再延伸。PCR产物电泳结果判断标准为：如果菌株属于同一类型，则电泳条带的数量和位置相同[9]。

2 结果

2.1 菌株资料 22株CRKP主要分离自新生儿科及ICU，分别占31.81%、27.27%，其余为脑血管科(18.18%)、其他科室(呼吸内科、胸外科、全科病房、血液内科、肾内科各占4.55%)。22例CRKP感染患者中，11例年龄≥60岁，6例年龄<28 d；呼吸道感染者13例；所有患者均患2种或以上基础疾病；20例患者住院期间有过≥2项的侵入性操作或治疗；20例患者住院期间使用抗菌药物种类≥2种。见表1。

表1 22例CRKP感染患者的基本资料

基础疾病包括：1肺部感染，2呼吸衰竭，3 AECOPD，4气胸，5肺挫伤，6肋骨骨折，7双侧胸腔积液，8胸腔闭式引流术后，9急性呼吸窘迫综合征，10冠状动脉粥样硬化性心脏病，11陈旧性心肌梗死，12高血压，13脑梗死，14脑出血，15脑疝，16重度颅脑损伤，17继发性癫痫，18化脓性脑膜炎，19梗阻性脑积水，20帕金森综合征，21阿尔茨海默病，22慢性肾脏病，23急性肾衰竭，24泌尿系统感染，25糖尿病，26重症急性胰腺炎，27急性梗阻性化脓性胆管炎，28低蛋白血症，29贫血，30失血性休克，31感染性休克，32脓毒血症，33 MODS，34右股骨粗隆间骨折，35左髋关节置换，36压疮，37早产儿，38低出生体重儿，39新生儿呼吸窘迫综合症，40先天性心脏病，41新生儿窒息，42新生儿坏死性小肠结肠炎，43小肠穿孔，44弥漫性腹膜炎，45新生儿高胆红素血症，46新生儿败血症，47慢性肺心病，48慢性心力衰竭，49心律失常；侵入性操作或治疗包括：A气管插管/切开，B机械通气，C深静脉置管，D留置导尿管，E留置胃管，F留置引流管，G使用肛管，H手术，I针灸，J胸腔穿刺术，K腹腔穿刺术，L腰椎穿刺术，M骨髓穿刺术，N使用纤维支气管镜，O血液透析，P血浆置换，Q输血；抗菌药物包括：a头孢呋辛钠，b头孢孟多酯钠，c头孢噻肟钠，d头孢他啶，e拉氧头孢，f头孢米诺钠，g头孢曲松钠/他唑巴坦钠，h头孢哌酮钠/他唑巴坦钠，i青霉素钠，j氟氯西林钠，k阿莫西林钠/克拉维酸钾，l哌拉西林钠/舒巴坦，m哌拉西林/他唑巴坦，n左氧氟沙星，o莫西沙星，p美罗培南，q亚胺培南/西司他丁，r万古霉素，s替加环素，t甲硝唑，u伏立康唑，v醋酸卡泊芬净

2.3 药敏试验结果 K-B法和微量肉汤稀释法结果显示，22株CRKP对IPM、MEM及ETP均耐药。抑菌圈直径和MIC值见表2。

2.4 碳青霉烯酶检测结果 采用MHT和Carba NP试验检测CRKP碳青霉烯酶，结果MHT阳性13株(K1-K9，K11-K14)，Carba NP试验阳性14株(K1-K14)。见图1。

表2K-B法和微量稀释法对22株CRKP药敏检测结果

Table2Antimicrobial susceptibility testing results of 22 strains of CRKP detected by Kirby-Bauer disk diffusion and broth microdilution method

菌株编号抑菌圈直径(mm)IPMMEMETPMIC(μg/mL)IPMMEMETPK1866512256256K21366>512>512>512K31666256128256K41266512512>512K51366643232K68661688K7116625664256K81366>512>512>512K91666>512>512>512K10136632128128K111919152561632K12666>512256128K131166256128256K141566256256512K15666643216K161514132563232K1716161451264128K18131110512128256K191716142561632K201615125121616K211714125123232K22181210 51232128

A:MHT阳性结果,ATCC 25922为阴性对照，160109043为阳性对照，171205332为试验结果阳性菌株；B:Carba NP试验阳性结果

图1CRKP碳青霉烯酶检测结果

Figure1CRKP carbapenemase detection results

2.5 PCR扩增耐药基因及测序结果 PCR扩增碳青霉烯酶检测阳性菌株，经测序结果显示，14株产酶菌株均携带KPC-2基因，K12菌株同时携带NDM-1基因。PCR扩增产物电泳结果见图2。所有菌株均未扩增出SME、IMI、IMP、SIM、VIM及OXA-48基因。

A:KPC基因;B:NDM-1基因;M：2 000 bp DNA Marker；阴：阴性对照；阳：阳性对照

图2KPC基因和NDM-1基因PCR扩增产物电泳图

Figure2Electrophoresis map of PCR amplification pro-ducts of KPC gene and NDM-1 gene

2.6 同源性分析 按MLST法22株CRKP可分为ST11、ST875、ST1964和ST571四种序列型，其中K1～K14为ST11型，K15～K17和K19～K21为ST875型，K18为ST1964型，K22为ST571型，MLST结果详见表3。按ERIC-PCR法分型可分为A、B、C三种类型， 其中K1～K14及K18为A型， K15～K17和K19～K21为B型，K22为C型，见图3。

2.7 菌株来源科室、住院时间及其同源性检测结果 分型结果相同的菌株中K1～K6同属ICU，K7～K10同属脑血管外科，其中K1与K2，K2与K3，K3与K5，K8与K9，K9与K10均有共同住院时间，K8与K9病床相连，且患者存在转科情况，K2、 K8均由脑血管外科转入ICU，K13、K14分别从ICU转入血液内科、肾内科。新生儿科K15与K16及K17均有共同住院时间，K19、K20和K21均有共同住院时间，K20与K21有共同住院时间， 见表4。

表3 22株CRKP MLST结果

M：2 000 bp DNA Marker

试验编号科室患者住院时间∗耐药基因MLST型ERIC-PCR分型K1ICU12月1日—2月27日KPC-2ST11AK2ICU2月5日—7月3日KPC-2ST11AK3ICU 4月5日—10月9日KPC-2ST11AK4ICU 10月8日—20日KPC-2ST11AK5ICU 9月21日—12月11日KPC-2ST11AK6ICU 10月30日—12月9日KPC-2ST11AK7脑血管科 1月24日—2月25日KPC-2ST11AK8脑血管科 4月1日—5月15日KPC-2ST11AK9脑血管科 4月20日—5月9日KPC-2ST11AK10脑血管科 5月8日—6月22日KPC-2ST11AK11胸外科 1月31日—3月9日KPC-2ST11AK12全科 8月18日—28日KPC-2、NDM-1ST11A

续表4 (Table 4， Continued)

*: K1患者住院时间跨2016—2017年，其余患者住院时间均为2017年;-：未检测

3 讨论

KPN碳青霉烯酶可水解包括碳青霉烯类抗生素在类的β-内酰胺类抗生素，如头孢菌素类、青霉素类及单环酰胺类，导致菌株对多种抗菌药物耐药，但其不能水解头霉素类抗生素。中国细菌耐药性监测数据[10]显示，2015年KPN对MEM的耐药率为2.90%，对IPM的耐药率为3.00%，仅过两年，KPN对MEM及IPM的耐药率分别上升至24.00%、20.90%，上升幅度在5倍以上，而感染CRKP后病死率高达47.90%[11]。本研究中22株CRKP对IPM、MEM、ETP的耐药率均达100%，对临床其他常用的抗菌药物也高度耐药。建议临床医生应根据患者的症状和体征，并结合药敏结果，严格选择抗菌药物，避免滥用抗菌药物。22株CRKP中有7株分离自新生儿科，6株分离自ICU；22例患者中，11例年龄≥60岁，6例年龄<28 d；所有患者均患2种或更多基础疾病，20例患者住院期间有过≥2项的侵入性操作或治疗，20例患者住院期间使用抗菌药物种类≥2种，提示病情重、基础疾病多、免疫力低、有创操作和(或)无创操作多、长期使用抗菌药物和(或)联用抗菌药物的患者可能易感染CRKP，与巴西学者Da silva 等[12]的研究结论一致。对具有上述特征的患者，医务人员应给予高度关注，尽量避免医院感染的发生。22株CRKP中13株从呼吸道标本中检出，表明细菌容易侵入呼吸道，引起呼吸系统感染，临床医生应加强患者气道管理，及时送检标本，争取做到早发现，早防控，早治疗。

迄今为止，已发现24种KPN的KPC亚型(KPC-1和KPC-2后被证实为同一型别)，其中KPC-2和KPC-3是国内外最常见型别，已在全球多个国家暴发流行[13-14]。本研究中，14株产酶菌株均携带KPC-2耐药基因，其中K12同时携带NDM-1基因，提示该院碳青霉烯酶基因存在多态性，但同时携带KPC-2及NDM-1基因的菌株表现出的耐药性与其他菌株无明显差异，可能是NDM-1基因并未表达或仅仅低表达。携带碳青霉烯酶耐药基因的14株CRKP，MLST分类属于ST11型，与中国CRKP菌株的主要流行基因型和克隆型一致[15]。该院还存在ST875型CRKP的克隆流行，此型全部分布于新生儿科，与祝俊英等[16]研究结果不同，可能与不同地区抗菌药物使用差异有关，且新生儿科的7株CRKP产酶试验均阴性，提示可能存在其他耐药机制。此外该院还存在ST1964和ST571两种序列型，但尚未在该院流行。

研究[17]证实，CRKP的耐药基因可位于以下基因元件上：包括可移动的质粒、整合子及插入序列等，可在不同患者、病区、医院、地区，甚至不同菌种间进行传播，造成大范围的流行。本研究同源性分析发现，K1～K14 MLST均为ST11型，ERIC-PCR分型均为A型；K15～K17和K19～K21 MLST均为ST875型， ERIC-PCR分型均为B型；K22菌株在两种同源性分析方法中均独立成一型，分别为ST571型和C型，以上菌株两种同源性分析方法结果一致。分型结果相同的菌株中K1～K6同属ICU，K7～K10同属脑血管外科，其中K1与K2，K2与K3，K3与K5，K8与K9，K9与K10均有共同住院时间，且K8与K9病床相连，K2是由脑血管外科转入，与脑血管外科的K7有共同住院时间，K8因病情加重后转入ICU，与ICU的K2与K3均有共同住院时间，血液内科的K13是由ICU转入的，与ICU的K3有共同住院时间，而肾内科的K14是由ICU转入的，与ICU的K3、K5均有共同住院时间，提示该院ICU、脑血管外科、肾内科和血液内科病区间存在ST11型CRKP的克隆传播。新生儿科分型相同的K15～K17和K19～K21中，K15与K16及K17均有共同住院时间，K19与K20和K21均有共同住院时间，而K20与K21有共同住院时间，说明2017年该院新生儿科存在ST875型CRKP暴发流行。针对此次ST11型和ST875型CRKP在该院的暴发流行，通过及时与相关科室沟通，隔离感染患者，加强医务、保洁等人员的医院感染防控意识，加强手卫生管理，及清洁和消毒床单元和共用物品，已基本控制该院CRKP的进一步播散。

近年来，CRKP在全球各地散发和(或)流行时有发生，甚至在曾经检出率较低的欧洲国家也出现了流行，对CRKP的监测与防控仍是一项非常重要的工作。临床医生应了解CRKP的耐药机制及分子流行病学特点，做好医院感染防控，减少CRKP的传播。