植物提取物主要抑菌活性成分分析及应用

戴诗云,毛哲浩,胡益祥,李凡荣,孙 瑞,高 治, 王 亮

(徐州医科大学，江苏 徐州 221004)

1 引言

我国幅员辽阔，地理环境复杂，这种独一无二的自然生态环境培育了大量的特有植物资源，为植物提取物活性成分的抑菌作用的研究提供了得天独厚的有力条件。如何利用这些植物资源的活性成分，研制出相关的抑菌药物成了现代生物科学重要的研究方向。本文主要是研究生活中常见的植物提取相关的活性成分对大肠杆菌等菌种的抑菌效果。

龙眼是无患子科龙眼属植物，目前在我国一些处于亚热带季风气候的地区有大面积的种植。现如今的龙眼果实加工大多为以龙眼干、果肉罐头为主，龙眼核在加工的过程中利用率不高，而研究龙眼核的医用价值、生产价值可以达到废物利用的效果，并且龙眼核作为生产的副产品，可以提高果农的收入。本文对龙眼核抑菌活性能力的研究也得出其具有相当大的潜力。石榴果皮中含有多种生物碱，抑菌实验证实，石榴果皮的醇提取物具有广泛抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、霍乱弧菌、疟疾杆菌等有明显的抑制作用，此外，石榴果皮的水浸剂在适宜的环境下对各种皮肤真菌也具有不同程度的抑制作用，所以在中医中石榴皮是治疗痢疾、泄泻、便血及遗精、脱肛等病症的良品；现代药理研究表明石榴果皮中富含蛋白质、氨基酸、糖及其酚类、有机酸、黄酮类、生物碱等化学成分，具有杀菌、降血糖、抗癌、免疫功能调节，增强心血管系统功能等作用，为今后石榴果皮的开发和应用提供理论依据。核桃叶又称胡桃叶，核桃叶中富含维生素C、B、D、E，胡萝卜素、胰岛素多糖、有机酸、无机盐等。对患有维生素缺乏症、甲状腺肿大、黄胆病、妇科病皮肤病等均有显著功效。

2 材料与方法

2.1 供试菌种

大肠杆菌、沙门氏菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌

2.2 供试植物材料

取市场上购得的新鲜龙眼去壳和肉后得到龙眼核，龙眼核50 ℃烘干至恒重备用；提前储备的石榴果皮，洗净，去除萼筒，手工取皮，室内阴干，粉碎后过40目筛4 ℃度冷藏备用；采购所得核桃叶，精心保存。

2.3 植物提取物制备所需材料

牛津杯(杯内径6 mm，外径8 mm)氨苄西林和头孢挫林药敏滤纸片。

ZPS-250智能生化培养箱、ES-315 TOMY高压蒸汽灭菌锅、T-203电子天平、BCN-1360B生物洁净工作台、FW100型高速万能粉碎机、PK121R冷冻离心机、THZ-82A水浴恒温振荡器、LXJ-Ⅱ旋转蒸发仪。

2.4 植物提取物母液的制备

龙眼核提取物制备[1]：将提前准备好的龙眼核用粉碎机粉碎成粉末，然后用T-203电子天平称取粉末100 g置于烧杯中，接着加入500 mL的乙醇并置于50 ℃恒温磁力搅拌器中搅拌浸提4h，4h后将浸泡后的溶液放入离心机。首先，打开台式的高速离心机，使离心机进入待机状态。要注意的是在离心时，离心管内所盛溶液不能超过离心管总容量的2/3，如若超出，易容易溢出。使用前后，都应注意转头内是否保持干燥状态。转换转头时应注意使离心机转轴和转头的卡口卡牢。离心管平衡误差应在0.1 g以内。选择离心参数：①按温度设置按钮，设定离心温度；②按速度设置按钮，可在RPM/RCF设置档之间切换，用数字键设置离心速度，回车确定；③按转头设置按钮，再用数字键设置转头型号，回车确定；④按时间设置按钮，再用数字键设置离心时间，回车确定；⑤离心机刹车或加速速度一般设置在0～4之间，不宜经常调整。将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧紧螺丝。按下离心机盖门，如盖门未盖牢，离心机将不能启动。按START键，开始离心。离心开始时，确保离心速度达到规定速度后方可进行下一步实验。如若出现因为试管放的不平衡导致离心机明显震动，应立即停止离心的操作，如有必要，应该直接关闭离心机并找出失误的原因。经离心得到上清液，连续浸提2次，合并上清液，在55 ℃温度下减压浓缩后定容至浓度为1 g/mL。

石榴果皮溶剂提取[4]：用T-203电子天平称取石榴果皮40 g，用5倍于样品的乙醇溶剂作为萃取溶剂，并且在30 ℃下浸提48h，用滤纸过滤，混匀后放入离心机离心，蒸发浓缩得到不同浸膏，再用25%乙醇溶解，定容至浓度为1 g/mL。

核桃叶提取物制备[5]：取事先准备好的核桃叶干粉，以70%乙醇为提取溶剂，回流提取3次(5 h-3 h-2 h)，合并三次提取的溶液，抽滤后蒸发掉上清液至膏状，定容10 mL备用。

2.5 菌悬液的制备

提前将实验所需菌种用合适的培养基进行活化，量取10 mL无菌水于试管中，然后使用接种环磨擦培养基表面，取出接种环，最后将接种环放入无菌水中，充分振荡摇匀得到菌悬液。

2.6 植物提取物抑菌活性的测定

龙眼核提取物对供试菌种的抑菌活性的测定：对病原菌丝生长的抑制作用采用生长速率法[2]。无菌条件下，用孔径为0.8 cm的打孔器取菌落边缘生长旺盛的菌种移入含有提取物0.01 g/mL的PDA 培养平板上 ( 极性小的粗提物先溶解在少量丙酮再与40-50 ℃琼脂培养基混合,以利均匀分散),于培养基内加等量无菌水为对照,每处理重复3次,26 ℃恒温培养,待对照菌落接近培养皿边缘时,测定菌落直径。

石榴果皮提取物对供试菌种的抑菌活性的测定：该步骤采用滤纸片法(k-b法)[6]。将采用高压灭菌法后的培养基冷却至45～50 ℃，在无菌环境下，将灭菌过后的培养基分别倒入培养皿中，每个培养皿1 mL，接着在每皿中加入准备好的菌悬液1 mL，用刮铲涂抹均匀，然后取用5%的鞣化柞蚕丝素粉混悬液浸泡3 h，干热灭菌后用无菌镊子夹取6 mm的圆滤纸片，分别浸渍提取液60s后取出，滤干提取液后贴于琼脂平板上，每皿放置三片，每个纸片间的距离等距，重复3次，将细菌置于28 ℃恒温箱24 h，最后使用十字交叉法测量抑菌圈直径，取其平均值作为实验结果。

杨桃叶提取物对供试菌种的抑菌活性的测定：将经过活化的试验用菌接种到营养肉汤培养基中，细菌经37 ℃培养24 h，使菌液浓度达到10.8 cfu/mL备用。在无菌条件下吸取适量的菌悬液加入到备用的平板培养基上，涂布均匀。灼热玻璃棒在直径为9 cm的培养皿培养基上烫出8 mm直径孔，每孔加入25 μL提取液，做3次重复，以水做空白对照。37 ℃条件下培养24 h，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。取其平均值作为实验结果。

3 实验结果与分析

实验结果见表1～3。

表1 不同供试植物的乙醇提取物的抑菌效果比较

注：-为抑菌圈直径为0，即无抑菌活性

表3 不同供试植物乙醇提取物浓度为25 mg/mL时的抑菌活性比较

由表1的抑菌结果可以看出：①核桃叶的乙醇提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌都具有较强的抑菌能力，对沙门氏菌的没有很强的抑菌作用。②龙眼核与核桃叶的乙醇提取物对这4种细菌的抑制作用顺序一致，即：金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>沙门氏菌。③石榴果皮的乙醇提取物对这4种细菌的抑菌能力相差不大。

由表2、3的结果可以看出：①在乙醇浓度很高时，龙眼核对指示菌没有抑菌作用。②随着提取物浓度的增加，石榴果皮、核桃叶对4种细菌的抑菌作用都有增强。③随着3种植物提取物的浓度的改变，3种植物提取物仍然是对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强。

由表1、2、3的结果可以分析：随着3种植物提取物浓度的变化，它们对4种细菌的抑制效果也有着不同的变化。因此，可以猜测它们抑菌能力变化的原因是不同浓度的提取物中含有的抑菌活性成分量不同，并且含有抑菌活性成分越多，对对应细菌的抑菌效果越显著。

4 小结与讨论

龙眼核对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌都具有明显的抑菌效果，但是对金黄色葡萄球菌的抑菌能力更为突出。在以后的实验研究中可以着重对龙眼核提取物抑制金黄色葡萄球菌做进一步研究。石榴果皮对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌直径大致相当，可见石榴果皮的活性成分的对所选的菌种的抑菌能力大致相当，在以后的实验研究上可以把突破点放在对石榴果皮提取物的活性成分能否对大部分细菌都普遍具有抑菌效果做进一步的研究。

实验结果表明核桃叶、石榴果皮、龙眼核都具有良好的体外抑菌能力，但目前对这三者都处于实验研究状态。未来龙眼核的实际应用应该在于对龙眼核保健食品的加工，应用于天然色素和食品着色添加剂，以及龙眼核提取液的纯化、精制和实际应用等。龙眼核的充分利用，对于提高龙眼的实用价值，提高农民种植龙眼的经济效益，有着深远的实际意义，有利于进一步拓宽农民增收渠道，产生一定的社会效益。

石榴果皮中含有丰富的药理活性成分，对人体的内分泌系统、消化道系统、生殖系统、心血管系统的疾病和抗菌、抗病毒等方面均有显著的疗效，但目前其药理价值还不能充分的应用于临床方面，未来可以加强石榴果皮提取的活性成分与临床应用方面的研究，在确保临床用药安全的前提下，为新药的开发打下坚实的理论基础。石榴果皮具有广阔的开发前景。

现代药理研究表明，核桃叶提取物与改善记忆和抗肿瘤等作用有很大的关系，为了更全面的了解核桃叶提取物的多方面活性，本文只研究核桃叶提取物活性成分对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌与金黄色葡萄球菌的抑菌能力，为核桃叶在未来的植物抑菌方面开发与应用提供一些理论基础。