分光光度法测定地表水叶绿素a的测量不确定度分析

孔凡亭，王 坤，赵芳辉

(山东嘉誉测试科技有限公司，山东 淄博 255086)

1 引言

测量不确定度是与测量结果相关联的参数，它表征了可以合理地赋予被测量的量值分散程度[1]。叶绿素是植物光合作用中的重要光和色素，是藻类重要的组成成分之一，其浓度与水环境质量有直接关系[2,3]。在地表水环境检测中，正确评估叶绿素a的测量不确定度具有重要意义[4]。本文用分光光度法对地表水中叶绿素a检测过程中引起的不确定度的各个分量来源进行了分析，并对其不确定度进行了合理的评定。

2 检测方法

2.1 方法依据

依据HJ897-2017 《水质 叶绿素a的测定 分光光度法》，对水中叶绿素a的测量不确定度进行评定。

2.2 方法原理

将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞。用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波长处测定提取液吸光度，根据公式计算水中叶绿素a的浓度。

2.3 操作步骤

按照GB/T14581、HJ/T91和HJ494中的相关规定进行样品的采集。样品的采集一般使用有机玻璃采水器或其他适当的采样器采集水面下0.5 m样品，湖泊、水库根据需要可进行分层采样或混合采样，采样体积为1 L或500 mL。如果样品中含沉降性固体(如泥沙等)，应将样品摇匀后倒入2 L量筒，避光静置30 min,取水面下5 cm样品，转移至采样瓶。在每升样品中加入1 mL碳酸镁悬浊液，以防止酸化引起色素溶解。

2.4 仪器设备

配真空泵和玻璃砂芯过滤装置，玻璃研钵研磨装置，TDZ5-WS台式低速离心机，15 mL玻璃刻度离心管(旋盖材质不与丙酮反应)，752 N紫外可见分光光度计(配10 mm石英比色皿)。

3 建立数学模型

3.1 叶绿素a含量

根据公式1计算叶绿素a含量：

c=

(1)

式(1)中：c为叶绿素a含量,mg/L；A664为试样在664 nm波长下的吸光度值；A647为试样在647 nm波长下的吸光度值；A630为试样在630 nm波长下的吸光度值；A750为试样在750 nm波长下的吸光度值；V1为提取定容后的体积，10 mL；V2为样品体积，L；δ为比色皿光程，cm。

3.2 叶绿素a浓度c的相对标准不确定度

由公式(1)可见，被测样品叶绿素a质量浓度c的合成不确定度，来源于样品前处理过程中样品体积(量筒)引入的不确定度u(V1)、样品提取时定容体积引入(容量瓶)的标准不确定度u(V2)、样品重复性引入的标准不确定度u(S)、比色皿光程的标准不确定度u(δ)、分光光度计透射比最大允差对测量值引入的标准不确定度u(CT)五个部分。根据不确定度的传播规律得出叶绿素a质量浓度c的相对标准不确定度，见公式(2)：

(2)

式(2)中：uc(C)为样品中叶绿素a含量测定的合成标准不确定度；u(V1)为前处理后样品定容体积引入的标准不确定度；u(V2)为样品体积引入的标准不确定度；u(S)为测量样品重复性引入的标准不确定度；u(δ)为比色皿光程引入的标准不确定度；u(CT)为分光光度计透射比最大允差对测量值引入的标准不确定度。

4 不确定度分量的来源分析

由检测方法和数学模型分析，其不确定度来源有以下几个方便：①实验中量取样品体积(500 mL量筒)引入的不确定度；②样品经前处理后定容体积(10 mL容量瓶)引入的不确定度；③测量样品重复性引入的不确定度；④结果测定中分光光度计比色皿光程引入的不确定度；⑤分光光度计透射比最大允差对测量值引入的不确定度。

5 不确定度分量的评定

5.1 样品体积(量筒)引入的标准不确定度

因本次测得值量取的样品体积为500 mL，所以选用500 mL量筒量取。500 mL量筒引入的标准不确定度主要来源于玻璃量具的最大允差、温度变化引起的体积改变。

5.1.1 500 mL量筒允差引入的标准不确定度

500 mL量筒(A级，量出式)最大允差为5.0 mL，属A类评定，则：

5.1.2 温度变化引起量筒体积变化的标准不确定度

设温度变化±3 ℃，水的膨胀系数α=2.1×10-4℃-1，则：

5.1.3 500 mL量筒引入的标准不确定度

500 mL量筒刻度线读数重复性的不确定度较小，可忽略不计。则500 mL量筒引入的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

5.2 定容体积引入的标准不确定度

定容体积引入的标准不确定度主要来源于玻璃量具的最大允差、温度变化引起的体积改变。

5.2.1 10 mL容量瓶允差引入的标准不确定度

按A级标准容器要求，10 mL容量瓶允差为0.02 mL，属A类评定，则：

5.2.2 温度变化引起容量瓶体积变化的标准不确定度

设温度变化±3 ℃，水的膨胀系数α=2.1×10-4℃-1，则：

5.2.3 定容体积引入的标准不确定度

10 mL容量瓶定容体积引入的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

5.3 测量重复性引入的标准不确定度

5.3.1 样品测量值

根据1.3操作步骤对某地表水样品进行测定(取样体积500 mL)，测量值为2.40 mg/m3,原始数据见表1，本实例中的不确定度评定以该测量值为对象展开。

表1 样品原始记录(取样量为500 mL)

5.3.2 实验方法

从近年来的地表水叶绿素q样品中，选取10组质量浓度值相近的平行双样的结果(样品体积均为500 mL，质量浓度在2～5 mg/m3)，见表2。计算重复性引入的标准不确定度。

5.3.3 评定方法与计算

5.3.3.1 评定方法

通过两次平行试验结果，计算出△i分散性标准差s(△i),进而推导出单次试验结果的标准不确定度Sp(qi),而Sp(qi)正是样品重复性引入的标准不确定度u(S)。

(2)计算公式如下：

△i=|q1-q2|

(3)

(4)

(5)

(6)

5.3.3.2 计算结果

测量样品重复性引入的标准不确定度和相对标准不确定度的计算如下。

(1)将每组样品测量值q1，q2代入公式(3)中，求出20个△i结果。

表2 平行双样数据统计

注：n为平行双样组次：q1，q2为平行双样的两个测量值

(7)

(4) 再将s(△i)结果代入公式(6)，得到单次结果的标准不确定度：

(8)

(5) 已知测量值为2.40 mg/m3，可得到测量重复性引入的相对标准不确定度为：

(9)

5.4 比色皿光程引入的标准不确定度

JJG178-2007 规定，比色皿光程最大允差为±0.5%，按照B类评定，则比色皿光程引入的相对标准不确定度为：

(10)

标准不确定度为：

u(δ)=1 cm×urel(δ)=1 cm×2.89×10-3cm。

5.5 分光光度计透射比最大允差对测量结果引入的标准不确定度

5.5.1 评定方法

分光光度计透射比的最大允差为T=±0.5%，用讨论系统误差的方法来计算该允差对测量值的影响。以叶绿素a测得值2.40 mg/m3进行评定，由表4可知，该样品提取液4个波长的平均吸光度值分别为0.016(A664),0.018(A647),0.012(A630),0.004(A750)，将此系列数据代入公式：吸光度A=lg(1/T)中将吸光度换算为透射比T，则样品提取液测定吸光度换算出的透射比分别为：T664=96.383%,T647=95.940%,T630=97.275%,T750=99.083%。

当透射比增加0.5%时，T+664=96.883%,T+647=96.440%,T+630=97.775%,T+750=99.583%，此时的吸光度值分别为：0.01375，0.01574，0.00977，0.00181。

当透射比减少0.5%时，T-664=95.883%,T-647=95.440%,T-630=96.775%,T-750=98.583%，此时的吸光度值分别为：0.01826，0.02027，0.01424，0.00620。计算结果见表4。

表4 透射比最大允差对测量值引入的不确定度分析计算

5.5.2 分光光度计透射比最大允差对测量结果引入的标准不确定度的计算

由表4可见，当透射比增加0.5%时，测量结果为2.39 mg/m3，当透射比减少0.5%时，测量结果为2.41 mg/m3，因此，可以认为透射比允差造成的不确定度半宽a是对称分布的。则

则透射比最大允差引入的相对标准不确定度：

6 合成标准不确定度

根据上述分析及计算结果，列出不确定度分量一览表，见表5。

合成相对标准不确定度：

表5 不确定度分量一览

当取样体积为500 mls时，样品质量浓度c=2.40 mg/m3。可计算出：

7 计算扩展不确定度

取包含因子k=2(约95%置信概率)，则扩展不确定度：

U=kuc(c)=2×0.08 mg/m3=0.16 mg/m3。

8 结论

(1)分析结果可以看出，用分光光度法测定水体叶绿素a，当采样量为500 mL，测量值为2.40 mg/m3时，测量不确定度结果表示为：(2.40±0.16)mg/m3，k=2。

(2)影响水体叶绿素a含量的测量不确定度分量主要是测量样品重复性引入的标准不确定度。

(3)采用估算法来评定分光光度计透射比最大允差对测量值引入的不确定度计算结果相对可靠直观。