连翘精油萃取及其在荔枝保鲜中的应用研究

何 勇，张晓虎，张峻伟

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000)

引言

药用植物连翘〔Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl〕果实中含有丰富的挥发性精油，其化学组成主要有单萜类、倍半萜类、三萜类、萜醇类以及环烯醚萜类化合物，α-蒎烯和β-蒎烯的含量占挥发油总量的60%以上，此外，还有含硫和含氮的化合物。因此，连翘果实精油化学成分比较复杂且具有多种生物学功能，如抑菌消炎、抑制病毒、抗氧化等。连翘精油作为具有潜力的一种新型天然食品防腐物，由于对食品风味的影响小、价格适中，已成为现代食品添加剂领域研究的重要课题［1-7］。

传统的连翘药用部位是其果壳，而富含精油的占果实重约1/3 的种子往往被废弃，造成资源浪费。陕西省商洛市是中国连翘主产区之一，野生、抚育及栽培的连翘面积、产量大，提取果实精油有利于促进当地连翘资源的综合利用［8］。研究以商洛连翘为对象，在单因素实验的基础上应用正交设计优化超临界CO2萃取连翘果实精油工艺，将连翘精油萃取物用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性试验，以荔枝贮藏试验检验连翘精油的保鲜效果，欲为萃取商洛连翘精油并用于食品保鲜提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 材料:连翘果实，2018 年10月采于商洛市商州区金凤山;新鲜荔枝，2019 年5月购于商洛市商州区五洲超市。

试剂:CO2(食品级，纯度＞99%，购于成都市缘和基业化工有限责任公司);95%乙醇(分析纯);蒸馏水。

菌种:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，购于成都埃法生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备 高速万能粉碎机(FS180-4 型，广州雷迈机械设备有限公司);超临界CO2萃取设备(WH890HA220-40-11 型，上海齐欣科学仪器有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9123A 型，北京中西远大科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 原料预处理 连翘果实冲洗后于60℃干燥至恒重，粉碎后过60 目筛，称取若干份(每份10 g)，用纱布包裹分装，密封待用。

1.2.2 连翘精油萃取 用CO2为萃取剂的超临界萃取连翘果实精油过程包括流体的压缩、萃取、减压和分离等，其中分离器中CO2通过净化后再压缩，重新回到CO2压缩机中，实现循环利用。

将包裹分装的预处理后的连翘样品置于萃取釜中，以CO2反复冲洗萃取釜，排尽其中空气后进行萃取，最后分离出CO2流体以获得连翘果实精油。准确称量萃取物，按式(1)计算连翘精油的萃取率(Y)。

式中:m1为连翘萃取物的质量，g;m0为样品质量，g。

1.2.3 单因素试验

(1)萃取温度对萃取率的影响

由于溶剂CO2的临界温度为31.6℃，萃取时的温度需高于此临界温度，故设定条件为:萃取用时90 min、萃取压力23 MPa、以浓度60%的乙醇为夹带剂，探究不同萃取温度(32、37、42、47、52、57℃)对连翘果实精油萃取率的影响。

(2)萃取压力对萃取率的影响

由于溶剂CO2的临界压力为7.39 MPa，萃取时的压力需高于此临界压力，故设定条件为:萃取用时90 min、萃取温度32℃、以浓度60%的乙醇为夹带剂，探究不同萃取压力(8、13、18、23、28、33 MPa，萃取压力最高不得超过35 MPa)对连翘果实精油萃取率的影响。

(3)萃取时间对萃取率的影响

在设定萃取压力23 MPa、萃取温度32℃和乙醇夹带剂浓度60%的条件下，探究不同萃取时间(30、45、60、75、90、105 min)对连翘果实精油萃取率的影响。

(4)乙醇夹带剂浓度对萃取率的影响

在设定萃取压力23 MPa、萃取温度32℃和萃取时间90 min 的条件下，探究不同乙醇夹带剂浓度(0、20、40、60、80、100%)对连翘果实精油萃取率的影响。

1.2.4 正交试验 基于单因素试验，选取3 个影响较显著的因子，每因子设置3 个水平，采用L9(33)正交试验确定最佳提取工艺参数。

1.2.5 抑菌效果试验

(1)培养基的制备

准确称量定量的琼脂粉于250 mL 锥形瓶中，加入蒸馏水，用软木塞堵塞瓶子，用牛皮纸包裹瓶子，用细绳拧紧，经混合充分，高压灭菌处理，以获得无菌培养基。

(2)菌悬液的制备

在装有9 mL 蒸馏水的试管中加入适量活化的供试细菌，混合充分制备细菌悬浮液，在试管中加入1 mL 完全混合的细菌悬浮液，加入蒸馏水制作不同浓度的细菌悬浮液。采用平板计数法，将浓度调到含菌体数106～107个/mL 的菌悬液，备用。

(3)抑菌圈的测定

滤片抑菌圈测定采用琼脂扩散法［9］。首先，将少量的连翘精油溶解在无水乙醇中，分别制备成质量百分比为0.5、1.0、2.0%的溶液，然后将浓度为1 ×105cfu/mL 细菌悬浮液均匀地涂在固化表面培养皿中，盖好平皿。将灭菌的直径为6 mm 滤纸浸泡在上述3 种含有连翘精油成分的乙醇溶液中，滤纸用无菌镊子夹起，等待1～2 min。干燥后轻轻贴在平板的表面上，每个板材贴纸3片，以无菌水为对照，在37℃下恒温培养48 h 后测量，结果为三次测量之平均值。

1.2.6 连翘果实精油对荔枝保鲜效果的指标测定 取无损坏、无病虫且大小均匀，未经防腐剂处理的新鲜荔枝，随机分成四组。将荔枝分别在含有连翘果实精油0.5、1.0、2.0%的乙醇溶液和蒸馏水中浸泡3 min，取出后放置在实验室通风处晾干，置于一次性消毒塑料盒中，室温下在纸箱中存放，以蒸馏水处理为对照组，贮藏期间取样一次的时间间隔为1 d/次，测定各项指标，重复三次，按式(2)计算失重率。

采用糖度计法测量荔枝浆中可溶性固体含量［10］，仪器经校正后，在棱镜玻璃表面滴下2 滴荔枝汁，观察，读取在光暗交汇处线上的刻度，即荔枝的可溶性固形物含量(%)，试验重复三次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

图1 萃取温度对萃取率的影响

2.1.1 萃取温度对萃取率的影响 分析图1 可知，47℃以下随温度的升高萃取率显著提高，但当温度超过47℃时，连翘果实精油萃取率明显下降。可能是由于温度低于47℃，萃取温度的不断升高，CO2 分子热运动加剧，从而会造成流体粘度降低，进而使流体可以迅速地携带连翘果实精油，因此显示出图中的上升趋势;当温度超过47℃以后，继续升高温度时，使得流体密度变小，其携带连翘果实精油的能力降低，所以显现出下降的趋势。故选择47℃为试验的较佳萃取温度。

2.1.2 萃取压力对萃取率的影响 分析图2 可知，当萃取压力小于23 MPa 时，连翘果实精油的萃取率随萃取压力的增加而升高，但是当萃取压力超过23 MPa 时，萃取率反而呈现下降的趋势。可能一方面是由于压力增加时，使得超临界流体的密度增加，流体携带连翘果实精油的能力提高;另一方面是由于压力过高时，超临界流体密度过大，反而阻碍了传质的效率，所以，萃取压力在23 MPa 后，继续增压，连翘果实精油的萃取率反而呈现下降的趋势。故选择23 MPa 为试验的较佳萃取压力。

图2 萃取压力对萃取率的影响

2.1.3 萃取时间对萃取率的影响

图3 萃取时间对萃取率的影响

分析图3 可知，随着萃取时间的增加，萃取率始终保持升高趋势，但从萃取率升高的幅度观察，当萃取时间超过90 min 后，其萃取率的增幅明显降低，从能耗的角度来看，萃取时间越长，能耗越多，考虑到节能和经济效益，故选择90 min 为试验的较佳萃取时间。

2.1.4 乙醇夹带剂浓度对萃取率的影响 分析图4 可知，随着浓度的增加，萃取率先升高后降低，当乙醇夹带剂浓度为60%时萃取率最高，继续增加乙醇夹带剂浓度，则其萃取率明显降低。原因可能是，连翘精油溶于乙醇，随浓度的增大，导致溶液极性变化，使连翘精油溶解度下降，萃取率降低。故选择60%为试验较佳的乙醇夹带剂浓度。

图4 乙醇夹带剂浓度对萃取率的影响

2.2 正交试验结果与分析

2.2.1 正交试验结果及直观分析 以连翘精油萃取率为指标，取单因素试验中萃取的时间、压力、温度3 个影响较大因素，每因素设置3 个水平设计正交试验。正交试验因素水平见表1，试验结果及直观分析见表2。

表2 直观分析可知:对连翘果实精油萃取率影响最大的因素是C(萃取时间);影响次之的是因素A(萃取压力);影响最小的因素是B(萃取温度)。综合分析可得最优组合:A1B3C3，即萃取压力为23 MPa，萃取温度为52℃，萃取时间为90 min。

2.2.2 正交试验方差分析 经试验数据分析处理，得出正交试验方差分析结果见表3。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验结果及直观分析

表3 分析可知，因素C 对应的F 比为2.246＜5.140，可得因素C(萃取时间)对连翘果实精油的萃取率影响显著;因素A 对应的F 比为0.603＜5.140，可得因素A(萃取压力)对连翘果实精油的萃取率影响较为显著;因素B 对应的F 比为0.151(0.151 ＜0.603 ＜2.246 ＜5.140)，可得因素B(萃取温度)对连翘果实精油萃取率影响不显著。综合分析可得:超临界CO2萃取连翘果实精油的最佳工艺条件是A1B3C3，即萃取压力为23 MPa，萃取温度为52℃，萃取时间为90 min。由此看出，正交分析结果与极差分析结果一致，在此条件下连翘果实精油萃取率为0.58%。

表3 正交试验方差分析结果

2.3 抑菌试验结果与分析

萃取的商洛连翘果实精油抑菌结果见表4。

由表4 可得，0.5%的连翘精油就有抑菌效果，2.0%的连翘精油对金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径为15.6 mm，对大肠杆菌的最大抑菌圈直径10.2 mm。表明连翘果实精油对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌效果大于对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑菌效果。

表4 连翘精油抑菌结果

2.4 保鲜试验结果与分析

图5 失重率指标测定结果

2.4.1 失重率指标测定结果 从图5 可以看出，随贮藏期延长荔枝失重率一直处于上升趋势，表明荔枝中的水分、养分在持续遗失，其质量愈来愈差，除以蒸馏水为对照组外，其它三组浓度处理的荔枝，前3 d 失重率基本保持稳定状态，表明连翘精油能有效减缓荔枝失重率的增大。3 d 后的处理组和对照组的荔枝失重率均呈明显上升趋势，但对照组失重率明显高于处理组，且处理组的连翘果实精油含量越高，其失重率越低。所以，连翘果实精油含量为2.0%的乙醇溶液对荔枝有较好的保水性，对保持荔枝品质的效果较为明显。

2.4.2 可溶性固形物含量指标测定结果 从图6可以看出，总体上随贮藏期延长可溶性固形物处于不断下降的趋势，表明荔枝的营养成分在持续损失，作为荔枝大量成分的可溶性固形物糖类物质，会因呼吸作用的消耗而不断降低。在第7 d时，2.0%精油溶液处理的荔枝可溶性固形物含量与初始值对比仅损失了1.9%，该组相比其它三组对可溶性固形物的保持效果更好。蒸馏水对照组对可溶性固形物的保持效果最差，与初始值对比损失了3.4%。所以，连翘果实精油含量2.0%的乙醇溶液能较好保持荔枝可溶性固形物含量，对保持荔枝品质的保鲜效果较为明显。

图6 可溶性固形物含量指标测定结果

3 结论与讨论

3.1 结论

(1)萃取试验结果表明，影响超临界CO2萃取连翘果实精油的因素顺序为:萃取时间＞萃取压力＞萃取温度;正交试验取得的优化工艺参数为:萃取时间90 min、萃取压力23 MPa、萃取温度52℃，在该条件下选择60%的乙醇夹带剂浓度获得的连翘果实精油萃取率为0.58%。

(2)抑菌试验结果表明，连翘果实精油对两种试验菌的抑菌效果为:金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌，2.0%连翘果实精油对金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径为15.6 mm，对大肠杆菌的最大抑菌圈直径10.2 mm，即连翘精油对革兰氏阳性菌的抑菌能力较强。

(3)荔枝贮藏试验表明，以失重率和可溶性固形物含量为指标的保鲜效果为:含有2.0%连翘果实精油的乙醇溶液能够有效降低失重率、较好保持可溶性固形物含量，可适当延长荔枝保藏时间。

3.2 讨论

本文采用超临界CO2萃取连翘果实精油，相比于水蒸气蒸馏法、醇提法，具有溶解性能好、传质性能高、流动性能强、提取效率较高、安全无污染等突出优点。但该技术亦有一定局限，如对设备要求较高、操作难度较大、能量消耗过大等，使其在实际生产中受到限制。

本研究以连翘果实为对象的精油提取率低于文献报道的以连翘种子为对象的精油提取率［5］，究其原因一是种子中连翘精油含量最高;二是10月份采摘连翘果实时，蒴果已发黄而开裂，相当一部分种子掉于树下土壤，所采果实中种子所剩无几［11］。

连翘果实挥发性精油是一种成分较为复杂的混合物，将连翘精油用于荔枝保鲜效果良好。鉴于时间、经费等的关系，本文未对连翘精油各组分做进一步分离纯化研究，未阐述其对新鲜果蔬防腐的保鲜机理，这些尚需在今后的相关研究中予以关注。