独角石斛组培快繁技术

陈 春

(福建省林业科技试验中心，福建 南靖 363600)

石斛兰属(Dendrobium)为兰科(Orchidaceae)中的三大属之一，有近2 000种原生种，主要分布在亚洲的热带、亚热带地区及大洋洲[1]。石斛兰花色鲜艳、摆放观赏时间长且品种繁多，园艺及观赏价值较高。独角石斛是石斛兰的一个小型种，其唇瓣反转似犀牛角，花瓣橙红色，唇瓣上布有深橙红色网纹。通常利用观赏石斛的植株侧芽进行分株繁殖以获得种苗。但兰科植物不易发芽，分株繁殖慢且生长不一致，因此，组培技术在观赏石斛上的应用前景广阔[2-3]。近年来，国内已有石斛兰组培方面的研究，大多以其种子作为外植体，较少以侧芽作为外植体[4-11]。本试验以独角石斛侧芽为外植体，对组培过程进行系统研究，以期为观赏石斛组培快繁及规模化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为栽培于福建省林业科技试验中心五板桥基地温室中的2年生独角石斛，取其生长健壮、无病虫害的当年生侧芽作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒与诱导 在天气晴朗的下午，剪取生长健壮、无病虫害独角石斛侧芽为外植体。将剪下的侧芽用0.1%洗衣粉浸泡5 min左右，之后切成5 cm茎段，用自来水冲洗3～5遍，放置于超净工作台上。用体积分数为75%酒精溶液消毒 30～60 s，再用HgCl2消毒15～20 min，最后用无菌水冲洗3～5遍，切割成2～3 cm茎段，接种到诱导培养基上。诱导培养基以MS+0.2 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂为基本培养基，并添加了不同质量浓度的6-BA。6-BA是石斛兰芽诱导较为重要的生长调节剂，适宜的浓度有利于不定芽的增殖。6-BA分别设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1，诱导培养基相应代号为Y1～Y6。每种培养基接种30 瓶，每个培养瓶接种1个外植体，重复3次。培养15 d后统计污染情况，培养30 d后统计不定芽的诱导率。

污染率/%=(污染的外植体瓶数/接种瓶数)×100

诱导率/%=(外植体分化瓶数/无菌瓶数)×100

表1 独角石斛增殖培养试验的因子水平表Table 1 Factors and levels of proliferation culture test

1.2.2 不定芽的增殖培养 将诱导培养获得的不定芽切下，接到继代增殖培养基中进行培养。6-BA和KT有利于不定芽的增殖，少量NAA有利于不定芽的生长。为此，以MS+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂为基本培养基，分别添加不同质量浓度的6-BA、KT、NAA(表1)。利用L9(34)正交试验，分析不同激素水平对独角石斛丛生芽增殖系数的影响。每个处理接种30瓶，每瓶接种1个不定芽，3次重复。45 d后统计丛生芽的增殖及生长情况。

1.2.3 不定芽的壮苗生根培养 将继代增殖培养获得的3 cm以上的丛生芽切下，接种到壮苗生根培养基中培养。生长素NAA和IBA对不定根的诱导有促进作用。本试验以1/2MS+0.5 g·L-1AC+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉胶为基本培养基，添加50 g·L-1土豆、50 g·L-1香蕉泥， NAA分别设置为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1，IBA为0.5 mg·L-1，壮苗生根培养基代号为R1～R5。比较不同质量浓度NAA及IBA对独角石斛生根情况的影响。每种培养基接种30瓶，每瓶接5丛， 3次重复，45 d后统计生根苗生长状况。

1.2.4 组培苗的移栽 当壮苗生根培养获得的生根苗长至5 cm以上，将瓶苗炼苗15 d后即可移栽。清洗组培苗根部的残留培养基，再用质量分数为0.1%多菌灵消毒15 s，之后种植在消毒处理过的水苔及树皮屑基质中，于温室大棚中培育。由于水苔和树皮屑的透气性和保水性好，适合石斛兰的移栽，本试验设置3个处理：T1为水苔；T2为水苔与树皮屑以1∶1混合；T3为树皮屑。每种培养基质种植30丛组培苗，3次重复。栽培期间应注意遮荫、喷水保湿，移栽45 d后观察小苗的移栽成活率及生长情况。

1.2.5 培养条件 组培培养室温度为23～25 ℃，光照周期为10 h·d-1，光照强度为2 000 lx；温室大棚湿度控制在70%～85%，温度25～30 ℃。

2 结果与分析

2.1 6-BA质量浓度对独角石斛不定芽诱导的影响

外植体培养15 d左右，不定芽开始萌发，30 d左右可统计不定芽的诱导率。由表2可知，不同质量浓度6-BA对不定芽的诱导率存在显著差异。 当 6-BA<1.0 mg·L-1或>2.0 mg·L-1时，不利于不定芽的诱导;当 6-BA为2.0 mg·L-1时，诱导率最高，达95.5%，不定芽生长健壮，叶片绿色；上升至3.0 mg·L-1时，诱导率降低，不定芽出现玻璃化现象。因此，以独角石斛侧芽为外植体可诱导出不定芽，在基础培养基MS中添加2.0 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA，不定芽的诱导效果最好。

表2 6-BA质量浓度对独角石斛外植体诱导的影响1)Table 2 Effects of 6-BA concentrations on the inductions of D.unicorneum explants

1)同列数值后附不同大小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平。

2.2 不同激素对独角石斛不定芽增殖的影响

图1 独角石斛继代瓶苗Figure 1 Subculture seedlings of D.unicorneum

不定芽接种到继代增殖培养基后，其增殖速度快，45 d后可长成丛状(图1)。方差分析表明，对独角石斛增殖系数影响最大的因素是6-BA，其次是KT，这两个因素的P值均为0，说明6-BA和KT对增殖系数的影响极显著(表3)。NAA对独角石斛增殖系数的影响不显著。

正交试验方差分析显示，5号独角石斛增殖系数(4.78)最大，在0.01水平上显著差异于其他处理的培养基(表4)。因此，选择独角石斛的最适增殖培养基为：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+0.4 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂。

表3 正交设计方差分析表Table 3 ANOVA Table of orthogonal design

2.3 培养基对独角石斛生根诱导的影响

当不定芽长至3 cm时，将其切下并转接到培养基上，经25 d的生根诱导培养，可获得生根组培苗(图2)。由表5可知，当NAA<0.4 mg·L-1时，不定根的生根率和生根条数均随着NAA浓度的提高而增加，R1～R3处理生根条数呈极显著差异；当NAA为0.4 mg·L-1时，生根率达100%，根数达5.7条；当NAA>0.4 mg·L-1时，对不定根的诱导反而不利。由表5还可知，仅添加IBA或NAA时，生根率及生根条数都极显著低于添加NAA+IBA的组合。因此，最佳生根培养基为：1/2 MS+0.4 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+0.5 g·L-1AC+50 g·L-1土豆+50 g·L-1香蕉泥+20 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉胶。

表4 独角石斛正交试验方差分析表Table 4 Variance analysis of D.unicorneum using orthogonal test

图2 独角石斛生根苗Figure 2 Rooting seedlings of D.unicorneum

表5 不同激素组合对独角石斛生根的影响1)Table 5 Effects of different hormone combinations on the rooting of D.unicorneum

1)同列数值后附不同大小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平。

2.4 基质对独角石斛移栽成活率的影响

1)同列数值后附不同大小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平。

从表6可见，不同基质对独角石斛组培苗的移栽成活率有显著影响。以水苔作为基质时，成活率(90.5%)最高且茎粗壮、叶色深绿，苗长势好(图3)；以水苔∶树皮屑为1∶1作为基质时，成活率较低；以树皮屑为基质，成活率最低且长势较弱。因此，选择水苔作为独角石斛的移栽基质。

图3 移栽45 d的独角石斛组培苗Figure 3 Seedlings of D.unicorneum transplanted for 45 d

3 小结

目前独角石斛尚未在市场上大量销售，关于其组培技术的报道较少。本试验以独角石斛侧芽作为外植体诱导不定芽，筛选出了最佳继代增殖培养基、生根培养基及栽培基质，以期为其产业化生产提供参考。不定芽诱导的最适培养基为：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂，诱导率最高，达95.5%；丛生芽的最适增殖培养基为：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+0.4 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂，增殖系数达4.78；最适生根培养基为：1/2 MS+0.4 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+0.5 g·L-1AC+50 g·L-1土豆+50 g·L-1香蕉泥+20 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉胶，生根率达100%，苗生长健壮；组培苗经15 d炼苗后，移栽到水苔基质中，45 d后成活率达90.5%。

本研究表明，以MS为基本培养基适合石斛丛生芽的增殖继代培养，这结果与蒙阳等[12]研究相一致。为了提高独角石斛移栽成活率，本试验通过在生根培养基中添加土豆、香蕉泥进行边生根边壮苗，提高了组培苗移栽成活率，与高燕等[13]研究相一致。