不同运动对生长期大鼠Wnt/β-catenin信号及软骨内成骨的影响

赵常红，李世昌 ，孙 朋

儿童青少年是人体骨骼发育的关键时期，运动作为一项有效的手段能够促进骨骼的健康生长。Wnt/β-catenin信号通路作为骨代谢重要的信号通路，调控着骨的生长与代谢。研究发现，儿童和青少年女性一次增强运动Wnt信号DKK-1总体显著下降[1]。优秀舞者中，BMD与Wnt/β-连环蛋白和ER通路的遗传变异有关[2]。这些结果表明，Wnt在人体骨骼对机械负荷的适应中起重要作用[3]。运动过程中，压力过大能异常激活软骨细胞Wnt/β-catenin途径[4]。有研究发现，运动激活Wnt信号成骨作用，与运动强度和持续时间相关[5]。经典的Wnt/β-catenin与软骨细胞肥大密切相关，许多研究揭示了Wnt信号通路在维持软骨内成骨稳态中的核心作用，促进Runx2在软骨细胞肥大时高表达[6-7]。通过运动影响Wnt/β-catenin信号通路，影响生长板软骨内成骨影响骨形成的表型及分子机制研究未见报道，本研究通过不同方式的运动，调控Wnt/β-catenin信号通路，探究运动对生长板软骨软骨内成骨的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组

本研究采用4周48只清洁级SD大鼠（雄性）作为实验动物，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：2015000526261，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。随机分成4组，每组12只，有对照组（control group，C组），游泳组（swimming group，S组），跑台组（running group，R组）和下跳组（down jump group，D组）。各组分笼饲养，定期更换垫料、鼠笼，相对湿度50%～55%，温度（24±3）℃。

1.2 运动方案

（1）C组：正常饲养，但不进行任何运动干预。

（2）S组：游泳训练池大小为50×60×50 cm（长×宽×高），水深4 0cm，水温（20±2）℃。前3天游泳运动18 min/d，以后第1周游泳运动30 min/d，第2周开始每天游泳运动50 min，第3周开始每天游泳运动60 min，每周训练6天。

（3）R组：前3天跑台运动18 min/d，以后第1周跑台运动30 min/d，第2周开始每天跑台运动50 min，第3周开始每天跑台运动60 min，每周训练6天，跑速为1.2 km/h，跑台坡度为0°。

（4）D组：前3天跳跃运动18 min/d，以后第1周天跳跃运动30 min/d，第2周开始每天跳跃运动50 min，第3周开始每天跳跃运动60 min，每周训练6天，下跳高度为20 cm，频率为7～8次/min训练。训练6周后，进行实验。

1.3 实验动物取材，测量各组胫骨和股骨的围度

取后肢胫骨和股骨，并左右分开，将肌肉和其他韧带组织剥离干净，并用电子秤进行称重，用游标卡尺测量胫骨和股骨最细部位矢状面的厚度并计算出围度，进行数据统计分析。

1.4 不同方式运动各组胫骨骨强度指标测试

胫骨放置在YLS-16A小动物骨骼强度测定仪马鞍形支架上，调好马鞍形支架和压头连接传感器，然后的中间压头缓慢施加压力三点弯曲试验，试验以胫骨断裂施压停止，压头回位，显示力学数值。注意压头压力尽量和胫骨受力点和受力方位一致，并固定防止滚动，保证实验数据的准确性。得到最大荷载（maximum load，N）力学参数指标的实验数据，然后进行统计分析。

1.5 Micro-CT相关指标检测

取后左肢骨股（去软组织），用4%多聚甲醛固定，立即送往上海澎赞生物科技有限公司进行Micro-CT（机子型号：Bruker Sksycan 1176）9 μm/每帧检测，然后得到各组股骨骨组织形态学相关指标，再对得到松质骨和皮质骨的相关数据进行统计分析。

1.6 生长板软骨细胞中相关细胞因子mRNA和蛋白检测

取生长板软骨放入液氮预冷过的研钵研磨，提取RNA反转录为cDNA，用SYBR荧光定量对Wnt/β-catenin信号及下游基因进行检测，引物（见表1）由Primer Premier 5软件设计，由博尚生物科技有限公司合成。加裂解液研磨，然后移入1.5EP管中冰上放15 min；4℃离心10 min，取上清，加入等体积loading buffer100℃解构，跑胶转膜，用丽春红染带，剪膜标记目的蛋白，放入暗盒用5%的脱脂奶粉封闭1 h，然后加入目的蛋白一抗4℃过夜，用PBST洗5 min/3遍，加入相应的二抗2 h，再用PBST洗15 min/3遍，最后扫膜，用ImageJ软件进行灰度值分析。抗体分别购于abcam和CST公司。

表1 引物序列一览表Table1 List of Primer Sequences

1.7 实验数据的处理

实验数据用SPSS 19.0进行统计和分析，用Mean±SD（平均数±标准差）表示，统计分析均采用单因素ANOVA方差分析。

2 实验结果

2.1 重量、围度

实验发现，与C组相比，S组和R组的胫骨湿重无显著性差异（P＞0.05），D组的有非常显著性增加（P＜0.01），与S组相比，R组和D组有非常显著性增加（P＜0.01）；股骨湿重只有D组与C组和S组相比，有非常显著性增加（P＜0.01）（见表2）。

表2 运动后各组大鼠胫骨、股骨重量，围度比较（n=12，Mean±SD）Table2 Tibial and Femur Weight，Dimension of Rats in Different Ways Before and After Exercise

胫骨围度（测得的直径换算成周长）（见图1），与C组相比，S组和R组无显著性差异（P＞0.05），D组有非常显著性增加（P＜0.01），与S组相比，R组和D组都有非常显著性增加（P＜0.01），且D组较R组有显著性增加（P＜0.05）；股骨围度，只有D组与C组和S组相比有非常显著性增加（P＜0.01）（见表2）。

图1 不同方式运动后各组大鼠胫骨、股骨维度指标示意图Figure1 A Sketch Map of the Dimension of Tibia and Femur of Rats After Different Ways of Exercise

2.2 不同方式运动后生长期SD大鼠骨强度影响比较

骨强度仪测试后现，只有D组力学指标，与C组和S组相比有非常显著性增加（P＜0.01）（见表3）。骨强度力学测试产生显著性差异，可能骨的微结构骨密度产生变化导致的，进而做了精准的Micro-CT进一步研究。

表3 不同方式运动后各组大鼠胫骨骨强度比较（n=12）Table3 Comparison of Tibial Bone Strength in Rats After Different Ways of Exercise

2.3 不同方式的运动对生长期大鼠股骨Micro-CT相关指标的影响

本研究发现，不同方式运动后，各组间大鼠股骨松质骨BMD无显著性差异（P＞0.05）；TV、BV各组间无统计学意义；BV/TV只有R组与S组相比有显著性差异（P＜0.05）；TS只有D组与S组相比，有显著性差异（P＜0.05）；BS各组间无统计学意义；D组BS/BV与C组和S组相比，有显著性差异（P＜0.05）；BS/TV只有R组与S组相比，有显著性差异（P＜0.05）；Tb.Th只有D组与和S组相比，有显著性差异（P＜0.05）；Tb.N只有R组与S组相比，有显著性差异（P＜0.05）；Tb.sp只有R组与S组相比，有显著性差异（P＜0.05）。在这些指标当中，只有BMD有差异才具有参考价值（见图2，表4）。

图2 不同方式运动后大鼠股骨组织形态学相关指标比较Figure2 Comparison of Histomorphological Indexes of Rat Femur After Different Ways of Exercise

对大鼠股骨皮质骨BMD研究发现，只有D组与C组和S组相比有显著性增加（P＜0.05）；R组TV与C组相比有显著性增加（P＜0.05），D组的有非常显著性增加（P＜0.01）；与C组相比，S组BV有显著性增加（P＜0.05），R组和D组有非常显著性增加（P＜0.01），与S组相比，R组和D组有非常显著性增加（P＜0.01），与R组相比，D组也有非常显著性增加（P＜0.01）；BV/TV比较发现，各组间无统计学意义；与C组相比，R组的TS有显著性增加（P＜0.05），D组的有非常显著性增加（P＜0.01），与S组相比，R组和D组有非常显著性增加（P＜0.01），与R组相比，D组的也有显著性增加（P＜0.05）；BS只有D组有非常显著性增加（P＜0.01），和R组相比有显著性增加（P＜0.05）；与S组相比，R组和D组BS/BV有显著性差异（P＜0.05），但与C组相比只有R组只有显著性差异（P＜0.05）；BS/TV组间无显著性差异（P＞0.05）；与C组比较，R组和D组Tb.Th都有非常显著性差异（P＜0.01）；Tb.N、Tb.sp各组间差异无统计学意义（见表5）。

表4 不同方式运动后大鼠股骨松质骨形态学相关指标比较（n=3）Table4 Comparison of Morphologic Indexes of Femur Cancellous Bone in Rats After Different Ways of Exercise

表5 不同方式运动后大鼠股骨皮质骨形态学相关指标比较（n=3）Table5 Comparison of Morphologic Indexes of Cortical Bone in Rats After Different Ways of Exercise

2.4 不同方式运动后Wnt/β-catenin信号通路相关mRNA表达比较

本研究发现，Wnt4mRNA的表达水平与C组相比，S组无显著性差异（P＞0.05），R组有显著性上调（P＜0.05），D组有非常显著性上调（P＜0.01）；Wnt8mRNA的表达水平与C组相比，R组和D组都有非常显著性上调（P＜0.01）；Wnt9mRNA的表达水平与C组相比，R组和D组有非常显著性上调（P＜0.01），与S组相比，R组有显著性上调（P＜0.05），D组有非常显著性上调（P＜0.01）；GSK3βmRNA的表达水平，只有D组与C组和S组相比有显著性上调（P＜0.05）；β-cateninmRNA的表达水平与C组相比，R组和D组都有非常显著性上调（P＜0.01），与R组相比，D组也有显著性上调（P＜0.05）；Runx2mRNA的表达水平与对照组C组相比，S组无显著性差异（P＞0.05），R组有显著性上调（P＜0.05），D组也有非常显著性上调（P＜0.01）（见表6）。

表6 Wnt/β-catenin信号通路mRNA表达比较（Mean±SD）Table6 Comparison of Expression of mRNA in Wnt/β-catenin Signaling Pathway

Wnt8蛋白表达水平与C组相比，S组无显著性差异（P＞0.05），R组和D组都有非常显著性增加（P＜0.01），D组与R组相比也有非常显著性增加（P＜0.01）；β-catenin蛋白表达水平与C组相比，R组有显著性增加（P＜0.05），D组有非常显著性增加（P＜0.01）；Runx2蛋白表达水平与C组相比，S组无显著性差异（P＞0.05），R组有显著性增加（P＜0.05），D组有非常显著性增加（P＜0.01），D组与R组相比也有显著性增加（P＜0.05）（见表7，图3）。

表7 Wnt/β-catenin蛋白表达比较（Mean±SD）Table7 Comparison of Expression of Wnt/β-catenin Protein

图3 运动后各组Wnt/β-catenin蛋白表达比较Figure3 Comparison of Expression of Wnt/β-catenin Protein After Different Ways of Exercise

3 分析与讨论

3.1 不同方式的运动对大鼠后肢骨围度指标的影响

研究发现，生长期的运动可以通过骨膜扩张来增加皮质骨的大小[8]。本研究发现，跑台和下跳方式的运动对大鼠后肢胫骨和股骨维度的影响，S组和C组之间无显著性差异，说明游泳运动对大鼠胫骨围度的影响意义不大；R组和C组之间无统计学意义，而与S组有非常显著性差异，说明跑台运动能增强大鼠胫骨围度；下跳运动相比C组和S组都有非常显著的差异性，说明下跳相对2组胫骨围度的作用显著，相对于R组也有显著性差异，股骨围度只有D组与C组、S组有显著性差异，R组没有。这说明，下跳运动相对于跑台运动对大鼠胫骨围度的效果更为显著，下跳运动利于后肢骨围度的增加，对生长期大鼠骨的健康生长更为有利。B.M.LAPAUW[9]的研究也发现，机械力学刺激是决定骨骼大小的重要因素。

3.2 不同方式的运动对大鼠骨强度的影响

BMD虽然是预测骨强度的生物指标，但不能准确客观地反映实际骨强度的变化，只能作为预测骨强度指标之一[10]。骨强度是骨质和量的综合反映，最直接和客观反映实际骨强度的骨力学测试实验。最近的研究发现，骨作为运动的受力器官，主要对抗重力产生适应性变化，游泳运动虽有肌肉收缩力，但在低重力环境中对骨的作用影响很小，骨量并不增加。研究发现，克服重力的运动有助于皮质骨面积和厚度的增加，且骨膜的扩张是不可逆的，这对于骨的力学性能的增加是非常有利的[11]。

既然本实验发现，不同方式运动对后肢骨胫骨和股骨的围度产生差异变化，那么生物力学也就是骨强度力学方面是否也存在变化呢？于是，进行了胫骨三点弯曲力学实验。本实验结果显示，通过6周的不同方式的运动，D组的胫骨强度显著性增加，R组虽有上升趋势，但没有显著性差异，说明下跳运动对大鼠的胫骨强度有非常显著的增强作用，跑台运动在提高骨的骨强度方面没有下跳运动效果好，游泳运动效果更不理想。D组皮质骨BMD显著增加，力学测试也是D组显著增加，印证下跳组对骨的围度和力学指标的提高是有效的。这可能预示着，在实际的运动锻炼中跳跃运动既能促进骨的纵向生长，更有利于促进骨围度和力学性能的提高。

3.3 不同方式的运动对生长期大鼠骨Micro-CT相关指标的影响

作为儿童青少年，没有骨质疏松这一说法，随着营养、遗传的个体差异和环境的影响后，会出现生长发育的快慢和好坏之分。骨组织计量学也是一项重要的评价指标，其对于成年后的最低骨峰值、骨强度都有重要的意义。研究生长期大鼠的骨组织计量学指标，对预测和提高成年后骨质和量有重要意义。主要有以下指标：骨密度（BMD）、总体积（TV）、组织体积（BV）、骨体积分数（BV/TV）、骨表面积（BS）、骨表面积/骨体积（BS/BV）、骨表面积/组织体积（BS/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数（Tb.N）和骨小梁分离度（Tb.Sp）等。D组力学指标显著增加，是否表明在骨的形态计量学方面存在差异呢？出于前面这一结果预示，本研究进行了骨的Micro-CT扫描实验。统计结果显示，在松质骨BMD统计结果显示无差异性，说明不同方式的运动确实对单位松质骨方面无显著性差异，但皮质骨在骨密度方面下跳组较对照组、游泳组出现了显著性差异，与我们的力学测试结果高度一致，跑台组也有上升趋势，但无统计学意义。J.IWAMOTO等[12]研究也发现，8周的运动是皮质骨面积和矿物沉积率显著增加。这就让我们更有理由相信，下跳运动对骨强度相关的皮质骨厚度的增加有显著相关性。产生不同结果的原因，可能与运动方式的力学刺激性质有关[13]。

3.4 不同方式的运动对生长期大鼠Wnt/β-catenin信号通路的影响

经典的Wnt/β-catenin，是Wnt信号通路里目前研究最清楚的信号通路，在细胞核内积聚，与软骨细胞肥大密切相关。研究发现，中等活性的Wnt信号促进软骨细胞增殖，但随着活性进一步增大会增加软骨细胞肥大表达Col10、Runx2、MMP13和VEGF[14]。Wnt/β-catenin在调控发育软骨内骨化过程中发挥关键作用[15]。通常Runx2在软骨细胞肥大Wnt升高时高表达[16]。前期的研究已经报道，下坡跑能促进骨组织中Wnt/βcatenin的升高，而这种升高在骨的重塑中发挥重要作用，可以显著提高骨量，而这种效果在生长板软骨细胞中的表达还很少有研究报道[17]。许多证据表明，软骨细胞的肥大化Runx2表达是开关，若能调节Runx2表达进而调节此开关。Wnt信号和配体有多种类型，在软骨细胞分化中起着不同的作用，不同的Wnt蛋白在软骨细胞肥大分化中起不同的作用，Wnt3a、Wnt5b促进软骨细胞分化延迟性肥大[18-19]。Wnt4和Wnt8能促进Runx2表达增高，从而促进软骨细胞肥大化，wnt9a促进软骨细胞增殖和肥大分化[20]。在MSCs期间，Wnt11表达促进软骨细胞Runx2和Ihh表达[21]。Wnt5a骨髓间充质干细胞在软骨分化过程中具有双重功能。早期，Wnt5a诱导软骨形成和肥大通过细胞内钙释放通过G蛋白偶联受体（GPCR）激活[22]。后期，它可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制软骨细胞肥大和B细胞（NF-κBκ）蛋白活化，抑制Runx2[23]。骨骼的软骨细胞需要Wnt极化并适当定位以启动软骨内骨化程序[24]。阻碍软骨细胞和软骨膜中的Wnt分泌，延迟生长板中的软骨细胞肥大，并损害软骨膜成骨。研究表明，Wnt蛋白不仅调节软骨细胞群体内的分化和细胞通讯，而且调节生长板中软骨细胞和成骨细胞之间的交叉调节[25]。Wnt/β-catenin还会协同其他信号通路，如Ihh、BMP、IGF和FGF通路激活转录因子Runx2，调控整个软骨成骨过程[26]。

本研究结果显示，R组除Wnt4mRNA出现显著性差异外，其余的R组和D组mRNA和蛋白都出现非常显著性升高，而且在Wnt4mRNA出现D组较R组出现显著性升高，Wnt8蛋白表达上D组较R组出现非常显著性升高，β-catenin R组和D组mRNA和蛋白都出现非常显著性升高，D组上升更为显著，说明Wnt/β-catenin通路可能被激活，下跳运动更为有利；Runx2在D组和R组之间也有统计学差异，说明R组和D组这2种运动方式促进了软骨细胞肥大，进而促进生长板软骨细胞Runx2的产生，Runx2不仅有利于促进软骨细胞的肥大，而且有利于软骨细胞的矿化。由此可以推断，下跳运动更有利于Wnt/β-catenin信号通路激活，进而激活了Runx2的产生，进一步促进了生长板软骨细胞肥大分化、矿化和软骨内成骨生成。

4 结 论

本研究证实，6周的下跳运动能增加生长期大鼠胫骨和股骨湿重，提高胫骨强度，增加股骨皮质骨密度和骨组织体积，改善骨的健康参数，且效果优于跑台和游泳运动。其机制可能与下跳运动的力学刺激更有利于生长期大鼠生长板软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活，与促进Runx2的表达有关，最终导致生长板软骨细胞肥大分化和矿化的软骨内成骨增加。