超高效液相色谱-差分离子淌度质谱法测定化妆品中10种卡因类禁用组分

连显会 王春 孟宪双 白桦 孙小杰 薛宏宇 马强

摘 要 建立了化妆品中10种卡因类禁用组分的超高效液相色谱-差分离子淌度质谱测定方法。以正十二醇为萃取剂、四氢呋喃为分散剂在水中自组装形成超分子溶剂，并结合涡旋辅助对化妆品试样进行分散液液微萃取。考察了超分子溶剂的组成、用量及涡旋时间等参数对萃取效率的影响，以及差分离子淌度质谱对同分异构体的分离效果。结果表明，试样在4 mL正十二醇-四氢呋喃超分子溶剂中涡旋振荡3 min即可完成高效萃取，且可有效去除基质干扰，降低基质效应。差分离子淌度质谱在优化的载气、分离电压、补偿电压等条件下可将色谱难以分离的同分异构体（苯佐卡因和三卡因）实现淌度分离，解决了两种同分异构体由于色谱无法分离而不能准确定性和定量分析的问题。10种卡因类组分在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，方法检出限为0.2～8.0 μg/kg，方法定量限为0.4～20.0 μg/kg。在低、中、高3个添加水平下的平均回收率为70.7%～94.7%，相对标准偏差为1.2%～12.7%（n=6）。本方法步骤简便、 快速高效，适用于化妆品中10种卡因类禁用组分的同时分析测定。

关键词 超分子溶剂; 分散液液微萃取; 化妆品; 差分离子淌度质谱

1 引 言

随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，化妆品已经成为日常生活用品[1]，其质量安全也越来越受到消费者的关注[2]。化妆品通过皮肤吸收发挥美白、祛痘等功效，且长期与人体直接接触，使用过程中化妆品含有的化学危害物质会危害人体健康安全。为确保化妆品质量安全，开发化妆品中禁限用物质的检测方法尤为重要。普鲁卡因、苯佐卡因、丁卡因等组分是临床上常用的局部麻醉药，可能添加于晒后修复、祛斑、祛痘、去角质层、去皱/抗衰老等化妆品中，以达到减轻人体肌肤疼痛或不适的作用，并具有抗皱/抗衰老作用。但其具有中枢神经毒性和心血管毒性，由于人体肌肤毛细管丰富，容易被吸收并迅速进入血液循环，对人体健康造成严重危害[3]。因此，我国《化妆品安全技术规范》（2015年版）[3]、欧盟化妆品法规[4]及东盟化妆品指令[5]明确将普鲁卡因等卡因类化學物质列为化妆品中禁用组分。

样品前处理方法很大程度上决定了分析检测方法的灵敏度和准确性。目前，针对化妆品样品的前处理方法包括液液萃取[6，7]、固相萃取[8，9]等，但这些方法有机溶剂用量大、分析周期长、测试成本高，此外也会对实验人员和环境产生负面影响。因此，有必要发展快速高效、操作简便、绿色环保的前处理技术。超分子溶剂（Supramolecular solvent， SUPRAS）是指由两亲性化合物通过两相或分子间有序的自组装过程形成的一种具有纳米结构的胶束聚集体[10]。超分子溶剂萃取技术是由西班牙学者Rubio等[11]提出的一种以超分子溶剂为萃取剂的新型萃取技术，通常以烷基醇或烷基酸与四氢呋喃及水混合，形成不溶于水的反向胶束。与其它类型超分子相比，基于反向胶束的超分子溶剂最大优势在于溶剂中含有较高浓度的两亲化合物，在分析液体样品时可获得较高的浓度因子，其萃取作用主要体现在高疏水烷基链提供的疏水作用和亲水基团提供的氢键作用，且烷基链越长，疏水作用越占优势，特别适合萃取疏水性化合物[12～14]。

离子淌度作为一种气相电泳分离技术，其原理是离子在施加电场和惰性气体所形成的屏障腔体内进行迁移，离子在迁移过程中因价态、离子大小以及结构不同实现分离[15]。离子淌度质谱是离子迁移谱与质谱联用的一种新型分析技术，与单独使用质谱相比，该技术在离子源和质量分析器之间增加离子迁移管，使得待测离子经过预分离后进一步被质谱检测[16]。差分离子淌度质谱（Differential mobility spectrometry-mass spectrometry， DMS-MS）的离子淌度池由两个平行的金属板组成，作为离子迁移场区，离子通过气体流引入质谱系统，离子淌度池位于四极杆和锥孔之间，可在大气压条件下运行，并能够兼容质谱的所有扫描模式，具有设计简单、拆装无需破坏质谱真空系统等特点[17]，在化合物异构体分析[18]、降低基质效应[19，20]等方面显示出独特的优越性。

本研究以正十二醇为萃取剂、 四氢呋喃为分散剂，在水中自组装形成超分子溶剂，结合涡旋辅助对化妆品试样进行分散液液微萃取，建立了化妆品中10种卡因类化合物的超高效液相色谱-差分离子淌度质谱分析方法（图1）。本方法萃取效率高、基质效应低，且通过优化载气、分离电压及补偿电压等条件将色谱难以分离的同分异构体苯佐卡因和三卡因实现淌度分离，解决了两种同分异构体共存时无法定性和定量分析的难题，适用于化妆品中10种卡因类组分的同时分析测定。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ACQUITY超高效液相色谱仪（美国Waters公司）; QTRAP 6500+差分离子淌度质谱仪（美国SCIEX公司）; MS-H-Pro 数显型磁力搅拌器（北京大龙兴创实验仪器有限公司）; Milli-Q Integral 5型超纯水仪（美国Merck Millipore公司）; AB204-S型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）; CR 21N高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）; MS3型涡旋振荡器（德国IKA公司）; 甲醇、乙腈和四氢呋喃（色谱纯，美国Fisher公司）; 正戊醇、正己醇、正辛醇、正癸醇、正十一醇、正十二醇（百灵威科技有限公司）; 正庚醇、正壬醇（日本TCI公司）。

10种卡因类化合物标准物质： 普鲁卡因（CAS 59-46-1）购自日本TCI公司; 苯佐卡因（CAS 94-09-7）、盐酸氯普鲁卡因（CAS 3858-89-7）购自北京曼哈格生物科技有限公司; 利多卡因（CAS 137-58-6）、三卡因（CAS 582-33-2） 购自百灵威科技有限公司; 丁卡因（CAS 94-24-6）购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 阿米卡因盐酸盐（CAS 532-59-2）、布他卡因硫酸盐（CAS 149-15-5）购自加拿大TRC公司; 利索卡因（CAS 94-12-2）、普莫卡因盐酸盐（CAS 637-58-1）购自美国Stanford Chemicals公司，纯度均大于98%。

2.2 实验方法

2.2.1 标准溶液的配制 准确称取10种卡因类化合物标准品各10 mg（精确至0.1 mg），用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液。分别取10种物质标准储备溶液，配制成100 g/mL的混合标准储备液，4℃保存。以甲醇逐级稀释成系列浓度的标准工作溶液，现用现配。

2.2.2 超分子溶剂的制备 移取1.5 mL正十二醇和8 mL四氢呋喃，迅速注入50 mL玻璃离心管中，加入30.5 mL超纯水，420 r/min磁力搅拌3 min后， 3000 r/min离心10 min，用玻璃注射器移取上层有机相于玻璃瓶中，4℃下密封保存。典型的超分子溶剂自组装过程如图2所示。

2.2.3 样品处理 称取0.20 g试样（精确至0.01 g）于离心管中，加入4 mL超分子溶剂，涡旋振荡3 min后，以3000 r/min离心10 min，移取上层液体200 μL，加入200 μL甲醇，涡旋混匀，过0.22 μm微孔滤膜后，供超高效液相色谱-差分离子淌度质谱测定。

2.2.4 超高效液相色谱-差分离子淌度质谱条件 （1）色谱柱 ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm × 2.1 mm， 1.7m）; 流速： 0.3 mL/min; 流动相： 碳酸氢铵溶液（pH=9）（A）和乙腈（B）。（2）梯度洗脱程序 0～4.0 min，35%～90% B; 4.0～ 4.5 min，90% B; 4.5～4.6 min，90%～35% B; 4.6～6.0 min，35% B; 柱温： 30℃; 进样量： 5 L。（3）电喷雾质谱 电喷雾离子源; 正离子扫描; 离子源温度： 150℃; 喷雾电压： 5500 V; 气帘气流速： 30 psi，雾化气流速： 60 psi，脱溶剂气流速： 60 psi; 脱溶剂气温度： 600℃; 差分离子淌度温度： 225℃; 多反应监测（MRM）模式; 10种卡因类化合物优化的差分离子淌度质谱分析参数見表1，多反应监测色谱图见图3。

3 结果与讨论

3.1 超分子溶剂萃取条件的优化

3.1.1 烷基醇种类及用量的优化 选择具有两亲性的四氢呋喃分别与一系列不同碳原子数的烷基醇（正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇和正十二醇）组合生成超分子溶剂，对卡因类化合物进行萃取。超分子溶剂的萃取作用力主要体现在烷基链提供的疏水相互作用和亲水头基提供的氢键作用。如图4A所示，正十二醇/四氢呋喃/水超分子溶剂体系对10种卡因类化合物的萃取回收率为67.6%～95.1%，且回收率较稳定。正辛醇虽对部分物质萃取效果较好，回收率为64.1%～94.7%， 但对丁卡因及布他卡因的萃取效果较差，回收率仅为52.6%和42.6%，因此，选择正十二醇/四氢呋喃/水作为超分子溶剂体系。考察了正十二醇用量分别为1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 mL（保持溶剂总体积为40 mL）时样品的回收率，结果见图4B。当正十二醇用量≥1.5 mL时，样品的回收率较高且稳定。因此，正十二醇的用量选择为1.5 mL。

3.1.2 四氢呋喃用量的优化 作为超分子溶剂的重要组成部分，四氢呋喃起到溶解两亲物质使其在水中分散的作用。超分子溶剂的形成与正十二醇、四氢呋喃和水的比例有关。如四氢呋喃比例过低，正十二醇会析出形成沉淀; 如比例过高，四氢呋喃分散在水溶液中，体系不能实现分层。考察了四氢呋喃用量分别为2、4、6、8、10、12和14 mL（保持溶剂总体积为40 mL）时样品的回收率，结果见图4C。各目标物在8 mL四氢呋喃时回收率为79.0%～101.5%，且结果稳定，在其它用量时结果较为分散。

3.1.3 超分子溶剂用量的选择 考察了不同体积超分子溶剂（2、3、4、5和6 mL）对萃取效率的影响，由图4D可见，随着所加入超分子溶剂体积不断增加，萃取效率多呈现先增加后逐渐趋于平稳的趋势，当超分子溶剂体积达到4 mL 时，10种卡因类物质都有较高的回收率，超过4 mL时，萃取效率达到稳定状态。因此，选择超分子溶剂最佳用量为4 mL。

3.1.4  涡旋时间的优化 在超分子溶剂分散液液微萃取中， 引入涡旋振荡可促进超分子溶剂与目标物的充分混合，以便形成良好的乳浊液状态，促进传质过程。考察了涡旋时间分别为1、3、5、7、9、11和13 min时样品的回收率（图4E）。随涡旋时间的延长，回收率并无明显变化。当涡旋时间为3 min时，10种物质的回收率≥70%，且时间较短。因此，选择涡旋时间为3 min。

3.2 流动相的选择

分别考察了反相色谱常用的有机相溶剂甲醇和乙腈与不同pH值（3、4、5、6、8、9和10）的缓冲溶液（酸性pH值用甲酸调节5 mmol/L乙酸铵溶液，碱性pH值用氨水调节5 mmol/L碳酸氢铵溶液）组成的流动相体系，对目标化合物的色谱分离行为和离子化效果的影响，结果表明，乙腈-碳酸氢铵溶液（pH=9）获得了最为理想的色谱峰形和分离效果，且质谱信号响应较强。

3.3 差分离子淌度质谱参数的优化

通过色谱分离技术难以将同分异构体苯佐卡因和三卡因完全基线分离（图5A），因此，在方法应用中，无法对二者进行精准的定性及定量分析。本研究通过差分离子淌度质谱技术对二者进行淌度分离，在开启差分离子淌度质谱功能后，电喷雾离子源及多反应监测参数无需改变，通过直接注射1 μg/mL的混合标准溶液进行差分离子淌度质谱相关参数优化。结果表明，在引入甲醇、乙腈及异丙醇作为修饰剂时，改变分离电压及补偿电压均不会增加同分异构体苯佐卡因和三卡因的分离度。通过优化未引入修饰剂下的差分离子淌度质谱温度、分离电压及补偿电压进行两种同分异构体分离，经详细优化上述参数，10种卡因类化合物的分离电压和补偿电压值见表1，补偿电压淌度分离图谱见图5B。经差分离子淌度质谱条件优化后，苯佐卡因和三卡因实现完全淌度分离。三卡因在补偿电压为1.7 V和苯佐卡因在补偿电压为7.0 V时的多反应监测色谱图分别见图5C和5D，可由此实现同分异构体的分离。

3.4 基质效应的考察

由于化妆品基质复杂，与卡因类化合物共流出组分可能会影响电喷雾效果，并对待测物信号产生增强或抑制，进而影响测定结果的精密度和准确度。对基质效应进行了考察，10种卡因类物质的基质效应为84.7%～103.0%（图6），表明采用超分子溶剂分散液液微萃取前处理方法处理化妆品样品可有效消除基质效应的影响[21，22]。

3.5 方法的分析性能

在优化的条件下，测定一系列不同加标水平的样品，以峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，绘制标准工作曲线。结果表明，10种卡因类组分在各自浓度范围内呈良好线性关系（r>0.99）; 分别以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）计算方法的检出限和定量限，检出限为0.2～8.0 μg/kg， 定量限为0.4～20.0 μg/kg（表2）。

选择膏霜类和水剂类化妆品空白样品，分别在20～100 g/kg范围内添加低、中、高3个水平的混合標准溶液，按照优化的方法进行分析测定，每个水平平行操作6次，计算回收率。结果表明，10种卡因类物质的平均回收率为70.7%～94.7%，相对标准偏差为1.2%～12.7%（表3）。

3.6 与已有方法比较

表4列出了本方法与文献报道的检测方法的比较结果。与传统的液液萃取法和固相萃取法相比，本方法检出限与之相当，但样品前处理相对简便，萃取和净化过程同时完成，避免了因繁琐操作步骤和较长前处理时间引入的实验误差。本方法采用差分离子淌度质谱技术，将色谱难以分离的苯佐卡因和三卡因同分异构体实现了淌度分离，有助于解决同分异构体的定性与定量分析难题。

3.7 实际样品分析

对市售的9件水剂类化妆品样品及9件膏霜类化妆品样品进行分析检测，结果表明，有1件水剂类样品和1件膏霜类样品检出普鲁卡因，含量分别为3.39 mg/kg和4.84 mg/kg。以1种含有利多卡因的林可霉素利多卡因凝胶外用非处方药剂作为待测样品进行了分析测定，检测含量与其标示含量相符。

4 结 论

采用超分子溶剂分散液液微萃取结合超高效液相色谱-差分离子淌度质谱技术，建立了化妆品中10种卡因类禁用组分的分析方法。分别对烷基醇的种类与用量、四氢呋喃用量、超分子溶剂加入量和涡旋时间等因素进行了优化考察，并且通过差分离子淌度质谱技术实现了苯佐卡因和三卡因同分异构体的淌度分离。实验结果表明，此方法准确可靠、操作简便、溶剂消耗量少，且解决了苯佐卡因和三卡因同分异构体的分离难题，适用于化妆品中10种卡因类禁用组分的同时分析测定。

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