基于铜纳米粒子/氧化锌/石墨烯修饰电极的电化学方法测定硫酸卡那霉素

梁彩云 刘凤平 张翠忠 张贞发 韦远玲 彭金云

摘 要 在氧化锌/石墨烯（ZnO/GO）修饰ITO电极表面电沉积铜纳米粒子（CuNPs）， 制备了一种新型的电化学传感器， 用于检测硫酸卡那霉素（KANA）。采用扫描电镜对制备的纳米材料以及修饰电极表面进行表征。优化后的测定条件为： 在0.15 mol/L PBS缓冲溶液（pH 6.5）中， 电沉积扫描圈数为40圈时， KANA在铜纳米粒子/氧化锌/石墨烯（CuNPs/ZnO/GO/ITO）电极上的电化学响应最大。KANA在电极表面的反应机理为单电子转移过程， 修饰电极有效表面积为0.482 cm2， 是裸电极的2.42倍。在0.99～30.6 μmol/L范围内， 响应电流与KANA浓度呈良好的线性关系， 线性方程为Ipc=5.183c-4.544×106， R2=0.9975， 檢出限为：0.31 μmol/L， 加标回收率为97.8%～103.6%。此传感器具有良好的稳定性与重现性， 可用于药物中KANA的检测。

关键词 氧化锌/石墨烯; 铜纳米粒子; 修饰电极; 硫酸卡那霉素

1 引 言

硫酸卡那霉素（Kanamycin sulfate， KANA）又名硫酸卡那辛， 是一种氨基糖甙类广谱抗生素， 其抗菌谱与新霉素相似， 临床上主要用于敏感菌所致的肺部感染、尿路感染、胆道感染败血症及腹腔感染等疾病的治疗 [1]。但是， KANA对人体具有一定的致敏反应， 高浓度的KANA对耳和肾脏等有毒副作用[2]。因此， 建立快速、准确、简便的KANA测定方法具有非常重要的意义。目前， 用于检测KANA的方法有高效液相色谱法[3]、分光光度法[4]、荧光光度法[5]、化学发光法[6]、电化学法[7，8]等。2015版第二部《中国药典》中采用高效液相色谱蒸发光散射法（HPLC-ELSD）测定单一杂质的KANA[9]， 该方法中蒸发光散射检测器（ELSD）浓度与峰面积不呈线性响应， 且未采用取对数拟合等方式进行校正， 导致定量分析结果存在不准确的风险[10]。电化学方法因具有检测速度快、灵敏度高、准确、测量范围宽、操作简单、成本低等优点而受到广泛关注。Han等[11]构建了单壁碳纳米管修饰的玻碳电极， 制备了聚邻苯二胺分子印迹电化学传感器检测KANA， 对KANA具有高选择性和准确度。Song等[12]报道了一种基于核酸适配体的检测KANA的电化学方法， 将末端修饰巯基（SH）的卡那霉素适配体固定在金电极表面得到适配体功能化的金电极， 以辣根过氧化物酶为催化剂进行信号放大， 实现对KANA的高灵敏度检测， 检出限低至nmol/L级。

氧化锌（ZnO）是一种性能优良的半导体材料， 可在各种基底上生长， 颗粒尺寸易于控制。作为电极材料， ZnO 与其它金属氧化物（如 Co3O4、NiO 等）相比具有价格低廉、反应电位宽等优势。然而， ZnO 在充放电过程中存在导电性差、体积效应大等缺点， 影响了 ZnO 作为电极材料的实际应用[13]。碳材料与ZnO制备的复合材料可以改善ZnO性能。石墨烯作为一种低维碳材料， 在常温下的电子迁移率达1.5×10 4 cm2/（V·s）， 电阻率低， 与金属氧化物复合可极大提升相应电极材料的电导率， 改善其充放电和循环性能[14，15]。同时， 石墨烯理论比表面积高达2630 m2/g， 可有效增强电极与电解液之间的导电接触[16]。Hsieh等[17]首先制备 ZnO/GO， 在 400℃还原气氛下焙烧获得 ZnO/GO， 与GO的复合有效改善了 ZnO 的电化学性能。因此， 许多研究将ZnO与GO掺杂， 对复合材料的应用性能进行了研究， 以期得到电化学性能更佳的材料[18～20]。

近年来， 采用纳米贵金属Ag[21]和Au[22] 颗粒掺杂金属氧化物（如半导体SiO2[23]、TiO2[24]）制备电化学传感器， 提高了检测灵敏度。Cu相对于其它贵金属具有更高的氧化电势[25]， 成本低， 并且具有良好的导电能力， 因而受到研究者的广泛关注[26]。本方法将CuNPs电沉积在ZnO/GO表面， 合成一种CuNPs/ZnO/GO复合新材料。 CuNPs与ZnO/GO间具有协同增效作用， 表现出更高的电化学催化活性。利用此复合材料修饰ITO电极， 采用差分脉冲伏安法（DPV）可达到简单、快速、准确分析药品中KANA的目的。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CHI620E电化学分析仪（上海辰华仪器有限公司）; EVO18电子扫描电镜（德国卡尔蔡司公司）; TGL-16C离心机（常州朗越仪器制造有限公司）; PHS-3C型pH计（上海精科实业有限公司）。玻碳电极（GCE， 直径3 mm）、饱和甘汞电极（SCE）和铂丝电极（天津英科联合科技有限公司）; 导电玻璃（Indium tin oxide， ITO， 华南湘城科技有限公司）。

乙酸锌（天津市大茂化学试剂厂）; 石墨粉（南京吉仓纳米科技有限公司）; 硫酸卡那霉素（福建省福抗药业股份有限公司）; KMnO4、CuSO4·5H2O （国药集团化学试剂有限公司）。以上试剂均为分析纯。 H2O2（30%， 广东光华科技有限公司）; 硫酸卡那霉素注射液（2 mL， 0.5 g， 山西省芮城科龙有限公司）。实验用水为二次蒸馏水。

2.2 GO的制备

采用改进的Hummer法[27]制备石墨烯（GO）， 具体步骤如下：冰浴条件下， 将5.0 g石墨粉缓慢加入到装有200 mL浓H2SO4的1000 mL烧杯中， 搅拌均匀， 控制混合溶液温度低于10℃。缓慢加入20.0 g KMnO4， 并将温度控制在约15℃， 搅拌2 h后， 升温至35℃， 继续搅拌2 h。在90℃条件下滴加400 mL水， 不断搅拌。滴加H2O2至溶液不再产生气泡。加入热稀HCl至约1000 mL， 静置10 min， 过滤上层悬浮液。杯底沉淀物中加入1000 mL热稀HCl， 静置， 上层悬浮液继续过滤。用水反复清洗滤膜上的GO固体， 于60℃真空干燥， 制得GO。

2.3 ZnO/GO复合物的制备

取ZnO/GO复合物采用水热法制备[28]： 将2.75 g 乙酸锌和1 g NaOH加入到25 mL 25% 氨水中， 搅拌均匀。准确称取0.0040 g GO， 置于干燥洁净的100 mL烧杯中， 加入20 mL水。取2 mL上述混合溶液滴加到GO溶液中， 不断搅拌。在60℃孵育30 min， 将溶液移至水热反应釜中， 180℃下反应24 h。 自然冷却， 多次离心水洗。将固体在45℃下真空干燥， 得到ZnO/GO复合材料。

2.4 电极的修饰

ITO导电玻璃电极的预处理：将ITO导电玻璃切割成0.5 cm宽的电极片， 于水中超声清洗20 min; 于丙酮中超声清洗30 min， 除去电极上的油脂; 于乙醇中超声清洗， 除去电极上的丙酮。最后， 用大量水清洗， 置于真空干燥箱中（50℃）烘干， 备用。

ZnO/GO/ITO电极的制备：称取5.0 mg ZnO/GO， 以0.5 mg/mL壳聚糖为分散剂， 配成2.5 mg/mL的悬浮液。吸取10 μL悬浮液滴涂在洁净干燥的0.5 cm×0.4 cm ITO电极上， 自然晾干， 备用。

CuNPs/ZnO/GO/ITO电极的制备[29]： 将处理好的ZnO/GO电极插入5 mmol/L CuSO4和50 mmol/L Na2SO4混合溶液中， 循环伏安法扫描40圈， 扫描电位为0.6～0.6 V， 静置时间为2 s， 使CuNPs沉积至ZnO/GO/ITO电极表面， 取出电极， 用水冲洗， 自然晾干， 备用。

2.5 电化学测定

电化学实验采用标准三电极体系， 以裸ITO电极、ZnO/GO/ITO电极或CuNPs/ZnO/GO/ITO为工作电极， 铂电极为对电极， 饱和甘汞电极为参比电极。电解质溶液为0.15 mol/L PBS （pH 7.0）， 采用循環伏安法（CV）、差分脉冲法（DPV）、电化学阻抗法（EIS）以及计时库伦法对修饰电极进行表征， 测定KANA含量。

3 结果与讨论

3.1 电沉积CuNPs循环伏安图

将裸电极和ZnO/GO/ITO电极分别放入5 mmol/L CuSO4和50 mmol/L Na2SO4混合溶液中， 采用循环伏安法电化学沉积CuNPs， 扫描圈数为20圈， 循环伏安曲线如图1所示。峰电流随着扫描圈数的增加而增大， 说明CuNPs已沉积在电极的表面。

3.2 扫描电镜表征

采用扫描电子显微镜对复合物以及修饰电极进行表征。将两根电镜专用玻碳（GCE）电极表面抛光处理干净后， 在其中一根电极上修饰ZnO/GO， 自然晾干。将两根电极分别放入到5 mmol/L CuSO4和50 mmol/L Na2SO4混合溶液中电沉积CuNPs， 循环伏安扫描35圈（图2）。图2B为复合物ZnO/GO电镜图， ZnO呈花簇状分布在石墨烯表面， 形貌较为均一， 与文献[29]的结果一致。由图2C可见， CuNPs呈粒状， 均匀分布在CuNPs/GCE电极表面。图2D为CuNPs/ZnO/GO/GCE电极表面形貌图， 可观察到ZnO/GO在玻碳电极表面呈清晰的膜状结构， CuNPs均匀分布在ZnO/GO表面。

3.3 电化学交流阻抗测试

EIS是表征修饰电极表面性质的有力工具[30]。 不同电极的EIS谱图如图3所示， 其中电化学阻抗谱高频区的半圆直径相当于电子传递阻抗（Ret）。ZnO/GO/ITO电极（图3， 曲线b）的半圆直径比裸ITO电极（图3， 曲线a）明显减小， 说明ZnO/GO已修饰至ITO电极的表面; 而CuNPs/ZnO/GO/ITO（图3， 曲线c）的半圆直径与裸ITO（图3， 曲线a）电极的半圆直径相比明显增大， 表明CuNPs沉积至ZnO/GO/ITO表面， 阻抗值增大[31]。

3.4 KANA在不同电极上的电化学行为

KANA在不同电极上电化学行为如图4所示， 其中电沉积CuNPs扫描圈数为35圈。KANA在ITO电极上没有明显的响应峰电流（图4a）; 在ZnO/GO/ITO电极上的峰电流显著提高（图4b， Ipc=2.645×104A）， 这是因为GO的比表面积大、电导率高， ZnO/GO复合材料具有更大的电活性表面积， 对KANA的电催化活性高[19]。CuNPs/ZnO/GO/ITO电极上的还原峰电流最大（图4c， Ipc=5.504×104A）， 是ZnO/GO/ITO电极的2.1倍， 裸电极的39.2倍。原因可能是：小尺寸的CuNPs具有高的氧化电势， 因此CuNPs具备更好的催化能力[32，33]; 同时， CuNPs均匀分布在石墨烯表面， 活性位点暴露于材料表面， 具有更好的协同催化效应[34]。

3.5 计时库伦法测定电化学面积

通过计时库伦法可以测定电极的有效面积。根据Anson方程[35]可计算电极电荷量（Q）值：

其中， 法拉第常数F为96480 C/mol， 转移电子数n为1， C为标准物质K3[Fe（CN）6]的浓度， 扩散系数D为7.6×106 cm2/s， Qdl为可通过背景减除法消去的双电层电荷， Qads为法拉第电容。在1.0×103 mol/L K3[Fe（CN）6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中， 对电极的有效电化学表面积进行了测定。如图5所示， CuNPs/ZnO/GO/ITO （a）电极的Q与t1/2方程为：Q=3.52×104t1/2+8.27×105（R2=0.9993）， 裸ITO （b）电极的Q与t1/2的方程为：Q=1.45×104t1/2+1.24×104（R2=0.9979）。结合Q-t1/2曲线斜率和Anson方程， 计算得到CuNPs/ZnO/GO/ITO电极的有效表面积为0.482 cm2， 是裸ITO电极有效表面积的2.42倍， 因此KANA电化学响应更高。

3.6 KANA测定条件的优化

3.6.1 电沉积CuNPs扫描圈数的影响 如图6所示， 电沉积CuNPs扫描圈数在5～40圈内增加时， KANA在修饰电极上的还原峰电流逐渐增大， 沉积40圈后， 峰电流逐渐减小， 可能是随着扫描圈数增加， 电沉积的CuNPs数目增多， 当 ZnO/GO表面CuNPs过多时， 覆盖了部分ZnO/GO的活性位点， 因此峰电流下降。选择最优的扫描圈数为40。

3.6.2 pH值的影响 图7为9.9×105 mol/L KANA在pH 4.0～8.0的0.15 mol/L PBS电介质溶液中循环伏安曲线图， 从图7A可见， 随着pH值增大， KANA的还原峰电流先上升后下降， 当pH=6.5时， 峰电流最大， 故选择测定KANA的最优pH=6.5。随着体系pH值增加， 还原峰电位向负方向移动（图7B）， 其方程为Epc=0.05446pH+0.1089（R2=0.9925）， 曲线斜率与理论值（0.0592）接近， 说明转移电子数跟质子数基本相等[36]。

3.6.3 扫描速度的影响 在0.15 mol/L PBS （pH 6.5）溶液中， 不同的扫描速度（0.02～0.37 V/s）对KANA测定的影响如图8A所示。随着扫描速度增大， KANA的还原峰电流逐渐增大， 扫描速度在20～370 mV/s范围内， KANA还原峰电流与扫描速度平方根（v1/2）呈良好的线性关系， Ipc=0.0021v1/2+7.543×105（R2=0.9972）， 表明KANA在CuNPs/ZnO/GO/ITO电极上的反应主要受扩散控制[36]。还原峰电位随扫描速度增大而向负方向移动， 还原峰电位与扫速的对数呈良好的线性关系， Epc=0.055lnv-0.416（R2=0.9910）， 如图8B所示。根据Laviron方程[38]：

Epc=E0+m[0.78+ln（D1/2/Ks）-0.5lnm]-m/2lnv，m=RT/αnF（2）

其中， Epc为还原峰电位（V） ， v为扫描速率（V/s）， α为电荷转移系数（由于KAKA在修饰电极上的反应是不可逆反应， 因此α=0.5）， Ks为异相电子转移速率， D为扩散系数， n为电子转移数， T为开尔文温度， F为法拉第常数（96480 C/mol）， R为摩尔气体常数（8.314 J/（mol·K） ）。结合公式（2）以及Epc-lnv线性方程的斜率， 可计算出n=1.34， 即转移电子数为1。

3.7 标准曲线与检出限

在最优条件下， 采用DPV法考察峰电流与KANA浓度的关系。结果表明， 在0.99～30.6 μmol/L范围内， KANA浓度与峰电流呈良好的线性关系（图9）， 线性方程为Ip=5.183c-4.544×106（R2=0.9975）， 检出限为0.31 μmol/L（3σ）， 与文献报道的方法相比（表1）， 本方法具有较低的检出限和较高的灵敏度。

3.8 干扰实验

采用DPV法考察干扰物对CuNPs/ZnO/GO/ITO测定KANA的干扰情况。在1×105 mol/L KANA溶液中， 分别加入10倍浓度以上常见的无机盐、金属离子、可溶性有机物、药物及常见药物辅料， 发现加入10倍浓度咖啡因， 检测KANA的相对标准偏差RSD=9.5%， 对测定有一定的影响， 其它物质对KANA的检测基本无干扰（信号变化RSD <5%）。

3.9 重现性与稳定性

在最优条件下， 利用DPV 重复测定1×105 mol/L KANA 12次， 电流响应的RSD=0.55%， 表明CuNPs/ZnO/GO/ITO电极具有良好的重现性。

将CuNPs/ZnO/GO/ITO电极放置于洁净干燥的帶盖离心管中， 4℃保存， 每隔一天取出， 采用DPV对1×105 mol/L KANA进行测定， 结果表明， 随着保存时间延长， 电流响应值呈缓慢下降趋势， 第11天测定的电流响应值为初始值的96%， 表明此修饰电极具有良好的稳定性。

3.10 实际样品分析

为了考察CuNPs/ZnO/GO/ITO电极的实用性， 将本方法用于硫酸卡那霉素注射液的测定。以PBS缓冲溶液（pH=6.5）为稀释液， 将硫酸卡那霉素注射液稀释至5～10 μmol/L， 用DPV法检测， 并进行加标回收实验， 结果如表2所示， 回收率在97.8%～103.6%之间， 表明此方法可用于检测硫酸卡那霉素注射液中KANA的含量。

4 结 论

采用水热法制备ZnO/GO复合物， 将CuNPs 电沉积至ZnO/GO修饰的ITO电极表面， 制备修饰电极CuNPs/ZnO/GO/ITO， 此修饰电极对KANA具有良好的电化学活性。采用DPV法测定KANA， 在0.99～30.6 μmol/L浓度范围内与还原峰电流呈良好的线性关系， 检出限为0.31 μmol/L。此修饰电极的重现性及稳定性良好， 测定硫酸卡那霉素注射液中KANA时加标回收率为97.8%～103.6%， 表明此电化学传感器具有一定的实际应用价值。

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