基于数字离子阱的双向解离技术研究

徐福兴 陈新 陈志扬 周鸣飞 丁传凡

摘 要 在线形离子阱中，通过质量选择离子的碰撞诱导解离实现串级质谱分析。在现有的实验过程中，离子的碰撞诱导解离是通过在一对电极上加载偶极激发信号实现离子共振激发和碰撞解离，即单向离子激发。本研究基于数字离子阱技术，在线形离子阱的二对电极上加载离子激发电压，实现离子的双向共振激发，以提高离子的激发能量和碰撞解离效率。理论模拟计算和实验结果表明，在不同的q值和不同的激发频率下，双向激发获得更高的碰撞解离效率。此外，在q值为0.352、激发电压为0.5 V0-p、激发频率为107.93 kHz、解离时间为5 ms时，双向激发解离可以获得亮氨酸脑啡肽（m/z=556）更多的低质量数碎片离子峰，降低了离子阱质谱的低质量截止效应，显著提高了离子阱质谱的串级质谱分析性能。

关键词 离子阱质量分析器; 数字离子阱; 碰撞诱导解离; 双向激发; 解离效率; 低质量截止值

1 引 言

质谱分析仪是目前分析测试领域中最重要的科学仪器之一，广泛用于现代基础科学研究、食品安全、环境保护、国防、航空航天和医疗卫生等领域，已成为现代社会发展和科技活动中不可或缺的科学工具[1～5]。

串级质谱分析是质谱技术研究分子结构最重要的方法之一[6，7]，由于四极离子阱质谱仪可在单一质量分析器中具有离子存储、质量分析和串级质谱分析功能，使得离子阱质谱在分子分析中发挥了重要作用[8～10]。目前， 常用的串级质谱分析方法主要有碰撞诱导解离技术（Collision induced dissociation， CID）[11，12]、电子转移解离技术（Electron transfer dissociation，ETD）[13]、电子捕获解离技术（Electron capture dissociation，ECD）[14]和红外光解离技术[15]等，其中，碰撞诱导解离技术实施和操作方便，是目前应用最成熟、最广泛的解离方法[12]。在四极离子阱质谱的碰撞诱导解离过程中，通常是在离子阱中一对电极上加载离子激发交流信号AC，改变激发信号AC的幅值和频率，当AC频率等于某种离子的久期运动频率时，离子将被共振激发， 并远离离子阱束缚中心，获得更高的动能，实现离子高速运动，然后与阱中的缓冲气体分子发生碰撞解离[16，17]。

在CID过程中，离子通过碰撞将运动动能转换成足够高的内部化学键能，从而导致化学键的断裂，产生碎片离子[18，19]。有大量的研究集中于如何获得足够的内能沉积到离子中，促使离子具有更高的解离效率，获得更多的碎片信息，如脉冲q解离[20]、高振幅短时激发解离[21]和脉冲q动态CID技术[22]等。上述解离技术是在瞬间提高激发信号振幅，从而快速促使离子被激活，然后在低q值下捕获碎片离子，获得更低m/z离子。另外，还有其它方法增加离子内能的解离技术，如通过加热气体增加母体离子初始内能的热辅助碰撞诱导解离技术[23]; 以及通过增加缓冲气体的质量数提高离子碰撞能量[17]，改变数字方波占空比，实现直流驱动离子碰撞解离[24]。此外，本课题组前期研究中，运用多边形电极线形离子阱技术提高质量分辨率[25]; 在碰撞解离阶段，在离子阱的两对电极上加载正弦波激发信号，驱动离子实现双向共振激发解离，提高离子运动半径，并获得更高的内能[26]。上述解离技术都可有效提高离子的内部能量，使母体离子获得更高的能量发生解离，获取更多的碎片信息。

本研究基于数字离子阱技术，在线形离子阱的两对电极上（x方向和y方向）分别加载离子激发信号，通过改变数字方波激发信号的频率驱动离子共振激发，提高离子在阱内的运动动能，从而提高离子阱的串级质谱分析性能。初步模拟计算和实验结果表明，数字方波双向激发技术与传统的单向激发相比，离子的运动半径更大，因此可获得更高的碰撞能量，离子解离效率有较大提高。研究结果表明，本方法还可以获得更多的低质量数碎片离子信息。

2 理论模拟计算

模拟计算主要使用Axsim软件模拟离子运动轨迹[26，27]，在软件中使用数字方波信号加载驱动离子运动，束缚电压幅值为200 V0-p，占空比为50%，在模拟中使用硬球碰撞模型，其碰撞条件在是0.008 Pa的压力下，采用氦气为缓冲碰撞气体，温度为300 K，选择亮氨酸脑啡肽（m/z 556）离子用于模拟。在线形离子阱的x和y方向两对电极上分别模拟加载双向激发电压信号，离子可在两个方向上以相同的偶极激发信号同时被激发运动，优化激发频率和幅值，使得离子在其阱内运动路径和动能最大化，在模拟计算中，分别模拟了数字方波单向激发和双向激发模式，其离子运动轨迹如图1所示。通过模拟计算发现，当激发信号只加载在x方向电极时，离子在阱内仅沿着x方向运动（图1A）; 当在x和y方向两对电极上都加载激发信号时，离子在x和y电极的对角线方向运动（图1B），离子运动半径显著增加，同时，离子的振动幅度和碰撞能量也明显提高。

3 实验部分

3.1 試剂

亮氨酸脑啡肽（Leu-Enk）Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu（YGGFL，m/z=556 Da）、三肽Gly-Phe-Leu（GFL，m/z=336 Da）、四肽Gly-Gly-Phe-Leu（GGFL，m/z=393 Da）、五肽Gly-Gly-Phe-Leu-Tyr（GGFLY，m/z=556 Da）、七肽Phe-Leu-Leu-Val-Pro-Leu-Gly（FLLVPLG，m/z=759 Da）均购于吉尔生化（上海）有限公司，使用甲醇-水（50∶50，V/V，其中含有0.05%醋酸）配制成1×105 mol/L的溶液。

3.2 仪器结构

质谱系统：采用自主搭建的电喷雾离子源-离子阱质谱仪系统[28，29]。仪器真空系统主要分由三级差分抽气真空组成，由电喷雾离子源产生样品离子，通过采样孔、取样锥、四极离子导引杆进入离子阱质量分析器。其中第一级差分真空选用机械泵（抽速8 L/s）抽气，真空度可达到55 Pa。在第二级差分真空和第三级真空均使用机械泵（抽速8 L/s）和涡轮分子泵（600 L/s）组合抽气，真空测量仪选用CPG-600（日本Tamagawa公司）测量仪器真空度，离子阱质量分析器所在的第三级真空可达到4.15×103 Pa，在离子阱质量分析器内通入氦气作为碰撞气体，以对离子进行碰撞冷却和碰撞激发。通入氦气气体后的第三级真空度在8.6×103 Pa。

离子阱质量分析器：采用双曲面直线形离子阱质量分析器结构，在国内生产加工，其离子阱质量分析器的x0×y0=5 mm×5 mm，电极长度为36 mm。

电路系统：采用数字方波驱动离子阱技术[30～32]，其核心是数字测控电路，采用高速DSP（Digital signal processor）芯片以及FPGA（Field Programmable Gate Array）芯片通过直接数字合成技术（Direct digital synthesizing， DDS）设计而成，输出两组幅度为5 V的TTL 电平信号，一组提供给方波放大电路产生数字束缚方波（Digital trapping waveform）电压，另一组提供给辅助共振激发模块通过分频后得到数字激发方波（Digital excitation waveform）电压。在碰撞解離过程中，其激发信号频率根据不同样品的质荷比选择最佳频率。辅助共振激发电压和数字束缚电压通过高频变压器与双向模拟开关CD4066耦合后，施加到x和y方向的电极对上。通过晶体逻辑触发器控制CD4066对激发信号的输出，在解离阶段，提供一个电压为15 V的DC信号给模拟开关CD4066控制器，触发CD4066，使得在x和y方向电极上都加载激发电压，实现双向激发信号; 在其它时序阶段，无DC信号的输出，无法触发开关CD4066，则在y方向的电极对上没有激发信号，其信号加载方式如图2所示。电子倍增器（Channeltron electron multiplier）型号为CEM 4879（Burle/Photonis，美国）置于矩形离子阱x方向电极外侧作为离子探测器。数字采集模块包含模数转换电路和前级放大电路，对电子倍增器捕捉的离子后的电流信号进行放大和模数转换。此外，测控系统还控制着多路直流电源的输出时序，提供离子阱上的门控电压，控制离子的引出和存储。

4 结果与讨论

4.1 碰撞解离效率

在数字离子阱的碰撞诱导解离过程中，采用加载双向数字方波的激发信号，通过调节方波频率实现离子的共振激发，并与氦气发生碰撞，实现离子解离。根据理论模拟计算情况，选用亮氨酸脑啡肽样品（m/z 556）进行实验测试，解离时间为20 ms，数字束缚电压为200 V0-p，数字激发电压为0.5 V0-p，在碰撞解离实验中，通过改变激发频率的方法实现离子共振激发解离[31]。碰撞解离效率（CID效率）是碎片离子的丰度总和与母体离子丰度的比值，分别比较了在不同的q值下双向与单向激发的CID效率，结果如图3所示。在不同的q值下，双向激发比单向激发的解离效率都要高，当q值分别为0.352、 0.361、 0.389和0.414时，在获得最高解离效率时所对应的激发频率分别为108.00、111.76、117.01和121.43 kHz。当离子在同一q值下的相同数字方波激发频率时，双向激发频率比单向获得更高的离子碰撞能量，母体离子在解离时获取更多的内能，使得母体离子在双向激发条件下获得的解离效率更高。

选择三肽GFL（m/z=336 Da）、四肽GGFL（m/z=393 Da）、五肽GGFLY（m/z=556 Da）和七肽FLLVPLG（m/z=759 Da）样品，在q=0.352时， 对双向激发与单向激发分别进行研究，其解离效率如图4所示。结果表明，对于不同的质荷比的样品，在相同q值和激发频率下的双向激发频率获得的CID效率都比单向激发时高; 同时， 数字方波双向激发技术所得到的CID效率都较高，具有广泛的实用性。

4.2 碰撞能量转换效率

对于串级质谱分析，除离子解离效率外，解离时所得到的碎片离子类型和丰度也同样受到广泛关注，而碎片离子类型和丰度主要由母体离子内部能量决定[33，34]。已有的研究工作表明，可以通过亮氨酸脑啡肽解离时的碎片离子中a4（m/z=397）、b4（m/z=425）离子强度比值研究能量转移过程， 如验证脑啡肽在CID过程中的能量转移[17，35～38]。文献研究结果表明，形成a4离子需要更多的内能[32.33，36]。因此，a4/b4离子强度比值越大，表明在母体离子解离时具有较大的内部能量，反之亦然。在CID过程中，影响母体离子内部能量的因素很多，本研究主要研究数字方波双向激发与单向激发对母体离子的内部能量转换，通过测量亮氨酸脑啡肽的碎片离子a4/b4比值观察不同类型的激发技术对母体离子的内能转移。在q=0.352，a4/b4离子强度比值随频率变化的结果如图5所示。随着频率增加，离子强度比值逐步增加到最大值，之后缓慢降低，数字方波激发频率在107.93 kHz时， a4/b4比值最大，且双向激发下的a4/b4比值比单向激发高。这是由于在双向激发技术下，离子在阱内的运动半径更大，离子的动能也更大，使得在单位时间内分子离子间发生更多次碰撞，因此，在离子碰撞解离过程中，随着激发频率提高，离子获得的共振激发能量增大，离子与中性气体分子的碰撞频率也不断提高，母体离子在不断碰撞过程中积淀了更多内能，此时得到的碎片离子a4/b4比值最大; 但当激发频率持续升高时，电源频率逐渐远离离子的久期频率，使得离子的激发能量减小，此时，离子在碰撞过程中所能达到的最大能量降低，使得反映母体离子内能的a4/b4比值反而减小。图5清楚地显示了这一点。

4.3 串级质谱分析

在离子阱质谱的串级质谱分析中，低质量数截止值（Low mass cutoff，LMCO）是存在的主要问题[39，40]， 解决离子阱的LMCO问题一直是离子阱质谱研究的主要内容之一。在本研究中，隔离后的亮氨酸脑啡肽母体离子通过改变激发电压频率方法实现碰撞解离[31]，数字束缚电压为200 V0-p， q=0.352，激发电压0.5 V0-p，激发频率107.93 kHz， 解离时间为5 ms时，双向激发比单向激发在串级质谱分析过程中获得更多的低质量碎片离子，其谱图如图6所示。图6A是传统的单向激发技术实现的串级质谱分析谱图，得到的碎片最低质量数m/z=323，则更低的质量数碎片离子基本上看不到。但在双向激发技术下的串级质谱分析得到的质谱图如图6B所示，可以观察到更多的低质量数碎片离子，其最小的碎片离子峰m/z 177。这是由于在双向激发碰撞解离过程，增加离子运动行程和速度可以提高离子在碰撞过程中所获得的总能量，有助于母离子在解离过程中获取更大的内能。在解离过程中，母离子碎片产物在解离阶段不再与共振电源信号发生共振激发时，产物离子动能在没有完全转移之前都可能会与碰撞气体再次发生碰撞解离[33，34]，在碎片离子中，离子与气体分子相互的碰撞，进一步将部分动能转换成内能传递给离子，使部分碎片离子发生解离，得到更多的低质量数碎片离子。

5 结 论

本研究在基于数字方波驱动离子阱技术上，在离子阱的两对电极上加载双向偶极激发电压实现碰撞诱导解离。理论模拟仿真和实验结果都表明，本方法比传统的单向激发方法可以提高离子在阱内的运动范围，运动速度和动能，提高离子与缓冲气体的碰撞能量，提高了解离效率，同时还可获得更高的分子内能，使得实验中检测到更多的低质量数碎片离子峰，增加了离子阱的串级质谱分析性能，丰富了离子阱质谱在分子结构研究中的应用，可以获取更多的分子结构信息。

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