DNA条形码技术在加工食品鉴定中的应用

牛家乐，费鑫杨，傅寅旭，张 俊，潘迦明，陈 毓，王 旭

(杭州医学院检验医学院，浙江 杭州 310053)

近年来，食品安全一直都是备受关注的热门话题。全球各国政府针对大部分市场流通食品都制定、出台了严厉的法律法规，但在经济利益的驱使下，仍有部分不法分子通过各种手段进行造假掺假[1]。目前，我国食品安全问题主要体现在加工制作环节隐患大，同时批发零售和储藏等环节也存在问题[2]。在加工食品的制作过程中，高温灭菌、煎、炸、添加食品添加剂、食品防腐剂等处理不仅会改变原材料的形态、味道和口感，还会造成核基因结构的破坏[3]，这使得加工食品原材料的物种溯源鉴别变得相对困难。因此，迫切需要建立一些有效的检测方法来识别加工食品的来源，帮助准确地确定食品掺假造假行为。

目前国内和国际加工食品及其来源的鉴定方法有：一种是以传统的形态学检测法、显微法、光谱学、色谱法、质谱法等为代表的理化鉴定方法；二是以ELISA、等点聚焦电泳法、人工免疫凝集技术为代表的传统生物学鉴定方法[4]；第三种是以PCR技术、AFLP技术、DNA条形码技术为代表的现代分子检测技术[5]。相比之下，由于加工后食品的外观相似，传统的理化方法具有较高的假阳性率。传统的生物学鉴定方法也因性价比低、特异性差、灵敏度低等而存在局限性[6]。随着生物信息学数据库的不断更新建立，基于DNA检测的现代分子检测技术凭借DNA样本的稳定性和广泛性在加工食品的检测中发挥着相对重要的作用[7]。在各种现代分子生物学检测技术中，DNA条形码(DNA barcoding)被认为是一种基于分子生物学手段鉴定生物标本的技术，可以有效地鉴别原材料来源，以及工业食品链中出现的掺假现象[8-9]。因此，DNA条形码技术在加工食品鉴定的实际应用中具有广阔的前景。

1 DNA条形码概述

1.1 DNA条形码定义

DNA条形码技术最早由加拿大动物分类学家Paul Hebert在2003年提出，其理论依据是使用一段独立物种的特定DNA序列，对该基因区段设计通用引物，并通过PCR扩增和测序将序列与现有数据库进行序列比对，确定物种名称和生物实体之间对应的关系[10]。该方法类似于超市商品由条形扫码确定，并且利用A、T、G、C四个碱基的基因顺序识别物种，每个物种都能找到与其特异对应的DNA条形码序列。这种基于遗传信息的DNA条形码技术对已知和未知物种的鉴定使其在食品检测等领域发展迅速。

1.2 DNA条形码的优点

DNA条形码作为一种在食品鉴定领域具有广阔应用前景的分子技术，具有以下优势：(1) DNA序列是物种鉴别的金标准：它基于遗传信息，不受个体生长发育和外部环境的影响；(2) 公认的国际数据库信息：2003年，全球50多个国家的研究机构提出国际生命条形码计划(International Barcode of Life,IBOL)以实现DNA条形码用于物种鉴定的全球化标准。2010年，成功建立了昆虫、鱼类和鸟类等动物物种的DNA条形码数据库[11-13]，以及入侵生物和害虫DNA条形码信息库(INBIPS)、生命DNA条形码数据库(Barcode of Life Database,BLOD)[14]；(3) 通用引物的设计：通过特定分子技术(例如实时荧光定量PCR等)鉴定多个物种通常需要整合几对或甚至几十种引物探针，而DNA条形码只需要一对或几对引物即可达到预期的效果[15]；(4) 未知物种的发现和鉴别：对发现的未知物种，通过计算遗传距离、数据库比对以及构建进化树，实现物种的识别和定位[16]。

目前，动物DNA的数据库主要包括生命DNA条形码数据库(BOLD)、鱼类DNA条形码数据库(FBIS)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)，用于管理植物DNA的数据库包括NCBI、欧洲分子生物学实验室(TMBL)和日本DNA数据库(DDBJ)，以上系统均以DNA条形码为通用标准，并提供一个联机工作台，用于收集、管理、分析和使用DNA条形码。其中动物DNA条形码技术通常使用680 bp的线粒体CO I(Cytochrome C oxidase subunit I,CO I)序列作为靶标[17]，植物DNA条形码的靶标是国际生命条形码联盟植物工作组(Consortium for the Barcode of Life Plant Working Group)在2009年初步确定并推荐使用的叶绿体基因编码区(rbcL和matK)、间隔区(trnH-psbA)及核基因ITS[18]。随着DNA数据库的不断完善和DNA条形码技术的不断发展，国内外的许多专家学者对食品安全领域的掺假问题以及错贴标签等问题进行了深入的探究[19]。研究表明，DNA条形码技术可以避免形态学分类的缺陷，打破传统标准中PCR检测目标唯一性的局限，具有更广阔的应用前景。

2 DNA条形码技术在加工食品鉴定中的应用

随着食品全球化的发展和人们日益增长的需求，市场上加工食品数量和种类越来越多，但这也意味着替代类似物种和不受控制地添加外来物种将对消费者的健康构成重大风险。采用常规理化技术或DNA芯片等传统分子水平的鉴定技术，在加工食品鉴定中受到限制。目前，DNA条形码技术已广泛应用于动物、植物和微生物等领域[20-24]。作为一种简便而精确的鉴定方法，新兴的DNA条形码技术为加工食品的分类鉴定以及标签的合规性也提供了新的方向，在加工食品检测中的应用越来越广泛[25]。

2.1 DNA条形码技术在畜禽肉制品鉴定中的应用

在人类日常消费中，以家畜、家禽为主的肉及其加工制品的食用占比很高。由于商家对原材料进行了加工，使得消费者无法对肉质进行识别，只有通过技术手段才能进行鉴别，而DNA条形码技术因其特异性强、检出率高等优势而被广泛使用[26]。钟文涛等[27]利用DNA条形码技术对市售的50份牛羊肉制品的动物成分进行了抽查，结果表明，牛肉丸的掺假率高达50%，烤牛肉串和烤羊肉串掺假率分别为36.4%和35.7%。Quinto等[28]利用线粒体CO I基因为靶标，对美国54份野生动物肉制品进行检测，发现18.5%的商品存在虚假标签的问题。上述研究证明了DNA条形码技术在动物肉制品鉴定中的有效性。

2.2 DNA条形码技术在植物、动物源中药产品鉴定中的应用

中国已经确定的药用植物超过11000种，药材市场上鱼目混珠的现象有很多。刘冲[31]等建立的阿魏药材DNA条形码ITS2序列鉴别方法可准确、快速地鉴别出阿魏属药材的正品和混淆品。张立秋[32]等对白头翁、朝鲜白头翁、兴安白头翁3种药用植物和药材进行了形态分类和ITS2序列分子鉴别研究，为建立其分子鉴定方法提供有力依据。另外，杜鹤等[29]基于DNA条形码技术对14份市售鹿茸及其混伪品进行检测，其结果为鹿茸的鉴别提供了新的可行性方法。张红印等[30]利用DNA条形码技术对蜈蚣药材及其混伪品共50份样品进行鉴别，为蜈蚣药材鉴定提供新的方法。以上研究利用DNA条形码技术对中药产品进行鉴定，为保障临床用药安全和市场监管提供了新的技术手段。

2.4 DNA条形码技术在海产品鉴定中的应用

DNA条形码技术在海产品原料的可追溯性方面也特别有效[33]。Maralita等[34]利用DNA条形码技术对菲律宾市场上贴有标签的海产品进行鉴定，发现冷冻的沙丁鱼和金枪鱼鱼片有错帖标签现象，并且还发现一种标签为gindara的鱼排中含有对人类身体健康有害的鱼类。Chin等[35]运用DNA条形码技术对调味鱼罐头、鱼球爆米花及蟹饺等形式的共54种加工海产品进行检测，发现16%的样本有错帖标签现象。这些研究证明DNA条形码技术可以成为海鲜产品来源证明的有力工具，也为商业渔类产品的物种识别和真实性测试提供了一种强有力的评估方法。此外，为进一步提高DNA条形码技术的应用性，Rasmussen等[36]提出了更为经济的微型DNA条形码(mini DNA barcodes)技术，该技术可以有效地对经深加工并且DNA已经大量降解的食品进行鉴定[37]。随着近几年来mini-DNA条形码技术在海产品鉴定中的不断深入运用，Xiong等[38]运用DNA条形码技术及mini-DNA条形码技术发现中国市场上的烤鳕鱼片产品有58%存在错贴标签的现象，并且得出mini-DNA条形码技术相较普通DNA条形码技术更为敏感的结论。

3 小结

食品安全是国内外密切关注的热点。全球贸易谈判要求食品在准确的标签和物种可追溯性方面进行严格的认证。因此，各国贸易政策应符合这些要求，要确保食品安全性和可持续性[39]。但是，如果没有强有力的监测战略和实施基础，很难实现这一目标。DNA条形码技术是物种分类的有效工具，并且在食品错帖标签和原料追溯性方面发挥着重要作用。但是，该技术仍存在一些困难和挑战：首先，该技术依赖参考的数据库创建不够完善会导致许多不确定因素；其次，许多食品的原料来源具有相似基因图谱，线粒体多态性和线粒体DNA修复机制也会给鉴定带来一定困难[40-42]，此外，该技术还存在不能区分样本的地理来源和不能准确鉴定杂交物种种属信息[43]等缺点。

综上所述，尽管DNA条形码技术仍存在一些问题，但与常见的形态及理化分析鉴别方法，以及实时荧光定量PCR、SNP等检测方法相比，DNA条形码技术的分类覆盖率高、检测高通量等优势使其成为一项越来越适用的分子诊断技术[44]。随着DNA条形码数据库的进一步完善，DNA条形码技术在食品安全领域的鉴定能力将会得到不断的强化。随着越来越多的DNA条形码引物被设计和完善，标本鉴定过程可以在较短时间内建立并形成易于利用且稳定的系统，实现标准化和数字化[40]，这也将对食品安全监督领域产生巨大的影响[43]。