地毯草黄单胞菌分泌黄原胶的电镜观察

郑梅霞 朱育菁 刘波 陈峥 黄素芳

摘  要  为了研究地毯草黄单胞菌（Xanthomonas axonopodis）FJAT-10151产黄原胶的分泌行为，采用比浊法测定地毯草黄单胞菌的生长曲线，干重法测定黄原胶产量，2，4-二硝基苯肼显色法测定黄原胶中丙酮酸含量变化，通过扫描電子显微镜镜（SEM）和透射电子显微镜镜（TEM）观察地毯草黄单胞菌产黄原胶的分泌行为。FJAT-10151在发酵时间0～26 h为对数期，26～72 h为稳定期。菌株FJAT-10151为短杆状（约2 μm），端生鞭毛（约7.9 μm），菌体外面形成了一层较厚的荚膜，且许多菌体通过黄原胶连在一起，分泌的黄原胶呈棒状和网状2种形态，聚集或缠绕在细胞表面，其含量随发酵时间的延长而增加。菌株FJAT-10151发酵72 h可获得高品质黄原胶，其产量及丙酮酸含量最高。

关键词  地毯草黄单胞菌;黄原胶;显微观察;丙酮酸中图分类号  S31      文献标识码  A

Xanthan Gum Secretedby Xanthomonasaxonopodis

ZHENG Meixia， ZHU Yujing^*， LIU Bo^*， CHEN Zheng， HUANG Sufang

Agricultural Bio-Resources Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract  In order to study the xanthan gum secreted byXanthomonasaxonopodisFJAT-10151， The growth curve of FJAT-10151 was determined by the turbidimetric method. The yield of xanthan gum was determined by the dry-weighing method. The content of pyruvic acid was determined by the 2，4-dinitrobenzene hydrazine chromogenic method. The secretion of xanthan gum fromX. axonopodiswas studied by SEM and TEM. The result showed that the logarithmic phase and stable phase of FJAT-10151 was 0–26 h and 26–72 h， respectively. FJAT-10151 was a short rod of 2 μm long with 7.9 μm of flagellum on the ends， and formed a thick capsule outside， and many bacteria together with xanthan gum. Xanthan gum had flake and filamentous forms， and gathered or wrapped around FJAT-10151 surface. The yield of xanthan gum increased with the extension of fermentation time. The yield of xanthan gum and pyruvic acid reached the highest at the fermentation time of 72 h. We could obtain high quality of xanthan gum at the fermentation time of 72 h.

Keywords  Xanthomonasaxonopodis; xanthan gum; microscopic observation; pyruvic acid

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.027

地毯草黄单胞菌（Xanthomonas axonopodis）为典型的植物致病菌。地毯草黄单胞菌会引起细菌性叶斑病^[1]，李淑彬等^[2]报道了红掌对该病菌高度敏感，离体叶片接种第4天、盆栽植株接种第8天后，病叶率达到100%，红掌叶片感染地毯草黄单胞菌初期出现水渍状病斑，之后病斑面积不断扩大，病斑颜色加深逐渐变成灰褐色，后期整个叶片呈灰褐色腐烂状态。地毯草黄单胞也会导致棉豆的白叶枯病^[3]和柑橘溃疡病^[4]等植物病害，该菌分泌胞外杂多糖黄原胶是致病原因之一^[5-6]。郑梅霞等^[7]筛选获得了一株分离自福建顺昌黄龙病红心柚叶片的高产黄原胶的地毯草黄单胞菌。

黄原胶是一种酸性杂多糖^[8]，由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸以及丙酮酸构成^[9]，丙酮酸的含量赋予黄原胶良好的拟塑性和低剪切速率下高黏度的特性^[10]，可通过控制黄原胶中丙酮酸的含量调整多糖的应用途径^[11]。產黄原胶的微生物菌株有野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）^[12-14]、菜豆黄单胞菌（Xanthomonasphaseoli）^[15]、锦葵黄单胞菌（Xanthomonasmal vacearum）^[15]、胡萝卜黄单胞菌（Xanthomonascarotae）^[15]、葡萄黄单胞菌（Xanthomonasampelina）TS206菌株^[16]和少动鞘氨醇单胞菌（Sph ingomonaspaucimobilis）511菌株^[17-18]等。地毯草黄单胞菌分泌黄原胶特性的研究还不系统。

本研究通过测定地毯草黄单胞菌FJAT-10151的生长曲线，利用电子显微镜观察地毯草黄单胞菌发酵过程分泌黄原胶菌体形态的变化，研究该菌分泌黄原胶产量及其丙酮酸含量与发酵时间的关系，揭示该菌分泌黄原胶的生物学特性，为该菌黄原胶的工业化发酵生产提供理论基础。

1  材料与方法

1.1材料

菌种：地毯草黄单胞菌FJAT-10151由本实验室分离自福建省顺昌红心柚叶片，现保存在中国微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCC No. 10271。培养基：采用筛选获得菌株FJAT-10151时所用的培养基^[7]：蔗糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉5 g/L，pH 7.0。主要试剂：浓硫酸、苯酚、丙酮酸、2，4-二硝基苯肼和乙醇均为国产分析纯。主要仪器：xMark酶标仪（购自BioRad公司）、扫描电子显微镜（JEOL JSM-6380LV）、透射电子显微镜（HITACHI HT7700）。

1.2方法

1.2.1  发酵液制备  取FJAT-10151单菌落接种于种子培养基中，30 ℃ 170 r/min培养12 h，按2%接种量将种子液接种到400 mL发酵培养基中，30 ℃ 170 r/min振荡培养。

1.2.2  生长曲线制作  在30 ℃ 170 r/min条件下，以培养时间（h）为横坐标，细胞发酵液的吸光度值OD₆₀₀为纵坐标，绘制生长曲线。

1.2.3  黄原胶产量测定  取不同发酵时间的发酵液，离心分离，取上清，加入3倍体积的冷乙醇，4 ℃静置过夜，离心分离，无水乙醇洗涤3遍，70 ℃烘干，称重。

1.2.4  扫描电子显微镜分析  离心发酵液收集菌体，洗涤，参照陈梅春等^[19]对菌体进行扫描电子显微镜观察。4 ℃下，2.5%戊二醛固定18 h，0.1 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液漂洗，50%～100%乙醇逐级脱水，临界点干燥。金离子喷涂，扫描电镜15 kV下观察。

1.2.5  透射电子显微镜分析  离心发酵液收集菌体，超纯水洗涤3次，采用负染法^[20]对不同发酵时间的菌体进行透射电镜观察。用3%戊二醛固定样品后，用磷酸盐缓冲液洗涤3次后制作铜网底片，再用1%的磷钨酸染色，干燥后采用透射电子显微镜观察。

1.2.6  黄原胶中丙酮酸含量的测定  采用2，4-二硝基苯肼显色法^[7]测定黄原胶中丙酮酸的含量：分别取3 mL不同发酵时间的发酵液，离心分离，取200 μL上清，加入1000 μL冷乙醇，充分混匀，静置过夜，离心分离弃上清得多糖沉淀。向沉淀中加入1 mL去离子水溶解。取复溶的溶液700 μL加入到具塞试管，并加入等体积2 mol/L HCl，充分混匀后沸水浴水解3 h，使黄原胶侧链基团中的丙酮酸水解释放，取50 μL水解液，加入0.25 mL 2 mmol/L 2，4-二硝基苯肼，混匀。之后加入2 mL 1.5 mol/L NaOH溶液，在520 nm处测定吸光值。

2  结果与分析

2.1地毯草黄单胞菌FJAT-10151生长特性

地毯草黄单胞菌FJAT-10151的生长曲线如图1所示。OD₆₀₀值与发酵时间的关系为OD₆₀₀= 0.4311 lnt+ 0.5873（R²=0.9539）。实验结果表明，地毯草黄单胞菌的适应期非常短，接种后在较短时间内就进入对数生长期，在对数生长期间，OD₆₀₀值迅速增大到2.0。

2.2地毯草黄单胞菌FJAT-10151生长过程细胞增殖方式

地毯草黄单胞菌FJAT-10151培养14 h时的生长过程形态变化如图2所示。FJAT-10151进行二分裂增殖，首先是菌体长轴不断加长，由

短杆状变为长杆状（图2A，图2B），其次是细胞壁和细胞质开始从靠近菌体中间位置凹陷，将母细胞分成2个几乎相等的子细胞（图2C），最后是细胞膜凹陷将菌体细胞分裂成2个子细胞（图2D）。

2.3地毯草黄单胞菌FJAT-10151产黄原胶特性

随着发酵时间的延长，菌株FJAT-10151黄原胶分泌量逐渐增加，结果如图3所示。FJAT-10151发酵12 h时，黄原胶分泌量为（15.39±0.49） g/L，发酵48 h时，黄原胶分泌量为（18.92±0.58） g/L;0～120 h的发酵时间与黄原胶分泌量的关系方程为：C_XG=3.821 lnt+ 2.5488（R²=0.8891）。

2.4地毯草黄单胞菌FJAT-10151分泌黄原胶过程细胞形态变化

地毯草黄单胞菌黄原胶分泌过程菌体变化如图4所示。地毯草黄单胞菌FJAT-10151扫描电镜结果如图4A所示，菌体聚集黏连。地毯草黄单胞菌FJAT-10151菌体培养24 h时，菌体长1.3～ 2 μm，端生鞭毛约7.9 μm（培养17 h），在二分裂过程中，菌体显著加长表明细胞壁和细胞膜的扩展速度超过DNA的复制速度，这对黄原胶的合成非常有利，因为黄原胶合成的酶系和磷脂载体都存在于细胞膜上^[21]。FJAT-10151细胞周围有明显的黏液层（图4B，图4C），且表面疑似有通道（图4D），黄原胶通过此通道聚集或缠绕在细胞表面，形成厚厚的荚膜。

地毯草黄单胞菌在不同发酵时间分泌黄原胶特性如图5所示，黄原胶的生物合成是一个递增的反馈型代谢合成过程。初始阶段菌体细胞周围的黄原胶的产量与发酵时间呈正相关，到17 h可明显看到菌体周围厚厚的黏液层，在40、70 h时看不到明显的黏液层，但是在91 h时又能明显看到黏液层，即黄原胶的产量先增加后降低，之后又有一定量的增加，原因是一定时期后细胞开始自溶，胞内的酶有助于黄原胶的生物合成，所以黃原胶的产量又会增多^[9]。菌株FJAT-10151分泌的黄原胶结构有棒状（图6A，图6B）和网状（图6C，图6D）2种。

2.5地毯草黄单胞菌FJAT-10151分泌黄原胶的丙酮酸含量的变化

不同发酵时间黄原胶丙酮酸含量的变化如图7所示，发酵时间0～26 h，丙酮酸含量在0～ 0.56 mg/mL，72 h时达到最大值，丙酮酸含量达0.72 mg/mL。84 h之后，丙酮酸含量回落到0.53 mg/mL以下。以黄原胶中丙酮酸含量为指标选择的最佳发酵时间为72 h。

3  讨论

本研究前期通过苯酚-硫酸法从22株可产多糖胶质的菌株中筛选获得1株黄原胶的高产菌FJAT-10151，产量为8.65 g/L;通过16S rDNA序列的同源性分析鉴定为地毯草黄单胞菌^[7]。通过形态学观察、生理生化实验、革兰氏染色法鉴定该菌株为革兰氏阴性菌株，菌落较小，圆形、淡黄色，表面光滑且湿润、微隆，边缘整齐、不透明，具有迁移性^[7]。本研究通过电镜观察研究菌株FJAT-10151分泌黄原胶的过程，菌株FJAT- 10151为短杆状，端生鞭毛，菌体外面形成了厚厚的荚膜，黄原胶聚集或缠绕在细胞表面，且许多菌体通过黄原胶连在一起。

微生物的生长繁殖分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期^[21]，其中对延迟期和稳定期的研究具有重要的实际应用价值^[22]。菌株FJAT-10151的生长曲线未出现延迟期，说明菌株FJAT-10151适应期短，环境适应性较强;菌株FJAT-10151的生长曲线的稳定期很长，稳定期是菌体代谢产物大量积累的时间段，即该菌株能较长时间积累致病性原因之一的黄原胶^[5-6]，说明其致病力强^[23];菌株FJAT-10151的生长曲线没有出现衰亡期，可能是因为菌株FJAT-10151分泌黄原胶而影响OD₆₀₀吸光度的测定，这与朱艳蕾^[22]研究的菌株AY9产红色素而影响OD₆₀₀的吸光度一致，也未出现衰亡期。

菌株FJAT-10151在发酵后期黄原胶中丙酮酸的含量降低，根据Hsu等^[24]报道的黄原胶的代谢合成途径分析，当菌体细胞中丙酮酸浓度随着发酵时间逐渐增大，达到一定程度，由于底物抑制作用，就会有更多的丙酮酸基合成到黄原胶分子上。当发酵时间越长，发酵液中游离的丙酮酸含量越高，当达到一定浓度时，会导致发酵液pH下降，不利于黄原胶的合成，所以出现了黄原胶中丙酮酸含量降低的现象。为获得高丙酮酸含量的黄原胶，赵润宝等^[25]在发酵过程中添加游离的丙酮酸来提高所产的黄原胶分子中丙酮酸功能基团的含量。本研究中地毯草黄单胞菌FJAT-10151在发酵时间为72 h时，分泌的黄原胶中丙酮酸含量最高。莫晓燕等^[26]报道的黄原胶的最优发酵时间也是72 h，张建国等^[27]报道的野油菜黄单胞菌产黄原胶的最优发酵时间则是120 h。

黄原胶具有片状和丝状2种形态。黄原胶是由D-葡萄糖基主链及1个D-甘露糖和2个D-葡萄糖醛酸交替连接的侧链组成，部分连接主链的甘露糖被乙酰化，部分末端的甘露糖连有丙酮酸，丙酮酸基团可相互之间形成氢键，也可与乙酰基产生氢键。黄原胶分子是由无规则的线圈相互缠绕而形成的，当达到一定浓度时形成网络结构^[28]。黄原胶分子中，与主链C₃相连的支链通过氢键、静电作用等反向缠绕主链骨架，形成五重折叠的棒状螺旋结构^[29]，黄原胶分子间靠氢键形成双股螺旋，双股螺旋靠非共价键结合可排成整齐的“超级接合带状”的螺旋共聚体^[30]，当黄原胶浓度增大，黄原胶分子发生聚集，形成棒状。

地毯草黄单胞菌因正向调控黄原胶的合成而致病^[31]。钱韦^[32]根据已释放的基因组序列分析获得地毯草黄单胞菌与野油菜黄单胞具有高度相似的密码子使用模式。染色体的xps Ⅲ、xps Ⅳ、xps Ⅵ区域和一个35.3 kb基因簇的基因编码产物与合成黄原胶所需的前体糖核苷等衍生物的形成有关，xpsⅠ区域即gum基因簇基因產物与构成黄原胶的五糖重复单元的顺序性组装、残基修饰、重复单元间的聚合以及黄原胶的分泌有关^[33]。陆光涛等^[33]发现35.3 kb基因簇下的编码糖基转移酶wxcA基因影响胞外多糖的分泌，可能是影响胞外多糖合成过程的某一糖基的反应，也可能是因为影响细胞膜蛋白和分泌系统蛋白的正确组装或是细胞信号传导而影响胞外多糖的转运和分泌。

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