胡椒蔓和叶粗提物成分分析及对3种农业病原真菌活性研究

赵方方 韩丙军 李萍萍 马晨 吕岱竹 谢德芳 罗金辉

摘  要  采用氣相色谱-质谱联用技术对胡椒蔓和叶中化学成分种类及含量进行系统分析，并考察提取物对3种重要农业病原真菌的作用。结果表明，胡椒蔓和叶中化学成分种类复杂，而且减压浓缩与自然挥发相比得到的种类更多。胡椒蔓中胡椒碱相对含量最高，达到34.97%;胡椒叶中烯类化合物种类繁多，以δ-榄香烯最高，相对含量达到13.268%。除了胡椒碱、烯类等特征性成分，还含有大量如酸酯类、化学结构带环或桥的酮、醇类化合物以及甾醇类化合物。胡椒蔓和叶提取物在2.5 mg/mL浓度下即对3种农业病原真菌均表现出明显的抑制作用，其中对番茄早疫病菌的抑制作用最为明显，而且叶提取物对3种病原菌的抑制作用明显优于蔓提取物，同时得出2种提取物对3种真菌的毒力回归方程及EC₅₀等表征参数。研究表明，胡椒蔓和叶在农业病原菌防治中具有良好的开发潜力和利用价值。

关键词  胡椒蔓;胡椒叶;化学成分;病原真菌;抑制作用中图分类号  S567.23      文献标识码  A

Extracts from Tendrils and Leaves of Piper nigrum Linn.：Components Analysis and Activity to Three Types of Agricultural Pathogenic Fungi

ZHAO Fangfang^1，2， HAN Bingjun^1，2， LI Pingping^1，4， MA Chen^1，3， LYU Daizhu^1，2， XIE Defang^1，2， LUO Jinhui^{1，2，3，4*}

1. Analysis & Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Tropical Products （Haikou）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Haikou， Hainan 571101， China; 4. Quality Supervision and Inspection Center of Tropical Agro-Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract  The ingredients in the tendrils and leaves ofPiper nigrumLinn. were analysed by the GC-MS method， including types and amounts of the chemicals. The activities of the extracts to three types of critical agricultural fungi were also investigated. The results showed that abundant volatiles were included in the tendrils and leaves. More components were obtained by the way of decompressing concentration than natural volatilization. Relative content of piperine was the highest in the tendrils， about 34.97%， while that of olefins compounds were more in the leaves， represented by δ-elemene at 13.268%. Besides these characteristic components， plenty of fatty acids， esters， ketones and alcohols with rings or bridges were also obtained， as well sterols. The extracts at the concentration of 2.5 mg/mL evidently inhibited three types of agricultural fungi， most intensively onAlternariasolani. Furtherly， the extracts of the leaves demonstrated more inhibition on these fungi than the extracts of the tendrils. Toxic regression equations of the extracts to the fungi and the characterization parameters， such as EC₅₀， were also calculated. Potential exploration and utilization value of the waste ofP.nigrumLinn. in the prevention and treatment of agricultural pathogenic fungi were indicated by the results.

Keywords  tendrils ofPiper nigrumLinn.; leaves ofPiper nigrumLinn.; chemical components; pathogenic fungi; inhibition

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.017

胡椒（Piper nigrumLinn.）属胡椒科胡椒属多年生常绿藤本植物，是世界上重要的热带香辛料作物^[1]。中国胡椒种植面积和产量分别居世界的第6位和第5位，我国自1947年引入胡椒以来已在海南、云南、广西、广东和福建等省广泛种植，其中海南省占据90%以上^[2-3]。胡椒从种植到收获过程中会产生大量废弃物，根据在海南省国营东昌农场和东红农场的布点测算实验结果显示，每年每公顷结果胡椒树在栽培管理过程中对胡椒树进行整形剪蔓会产生鲜胡椒枝蔓约10 500 kg。但是，目前胡椒废弃物大都被随意丢弃，开发不充分，造成巨大的资源浪费^[4]。胡椒栽培管理过程中所产生的主要废弃物胡椒蔓和胡椒叶中蕴含着丰富的活性化学物质，具有巨大的开发利用价值^[5-10]。

目前，对胡椒的研究大都集中在对胡椒粒和胡椒根中化学成分的分析，而对胡椒废弃物中化学成分的研究还少有报道^[11-14]。葛畅等^[15]对胡椒鲜果果皮中糖类、有机酸、皂苷等进行了定性分析。张水平等^[16-17]从胡椒叶中分离得到两种抗氧化活性的物质扁柏脂素和野漆树苷。王延辉等^[18]对胡椒梗中挥发性成分进行研究，并比较了胡椒梗与胡椒中提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制能力。而胡椒主要废弃物胡椒蔓及胡椒叶中化学成分及其对农业病原菌的活性研究尚未见报道。

本研究以废弃胡椒蔓和叶为材料，对其化学成分进行分析，并分别对其提取物进行3种农业病原真菌的抑菌活性研究，以期为胡椒废弃物高效资源化综合利用提供理论依据和数据基础，对避免资源浪费和环境污染，提高胡椒的附加值和利用率，促进胡椒产业化升级都具有十分重要的意义。

1  材料与方法

1.1材料

胡椒蔓和胡椒叶样品：采集于海南省琼海市胡椒种植基地，日晒后40 ℃烘箱干燥待用。番茄早疫病菌（Alternaria solani）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和腐皮镰刀菌（Fusarium solani）由广东省微生物菌种保藏中心提供。Agilent 7890A-5975气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司），R-210旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司），万分之一天平（SHIMAZU），恒温培养箱，95%乙醇（分析纯）、甲醇、正己烷、丙酮（色谱纯）。

1.2方法

1.2.1  化学成分的提取  采用2种蒸干方法进行化学成分的提取。胡椒蔓和叶样品分别经小型粉碎机打碎、过筛后，称取6.5 g样品于1 L棕色玻璃瓶中，加入600 mL 95%乙醇，超声2 h后置于通风橱内浸泡48 h，浸泡液经过滤后收集滤液。方法一：分次吸取滤液至250 mL圓底烧瓶中，置于旋转蒸发仪上40 ℃蒸发至近干，用丙酮定容，过0.22 ?m滤膜，待测;方法二：将滤液置于蒸发皿中自然挥干，用丙酮定容，过0.22 ?m滤膜，待测。

1.2.2  气相色谱条件  色谱柱：DB-1 123-1033（30 m×0.32 mm×1 μm）;升温程序：200 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至260 ℃，保持10 min，以20 ℃/min升至280 ℃，保持4 min;进样口温度：250 ℃;载气：氦气，流速：6.5 mL/min;进样量：1 μL;进样方式：不分流进样。

1.2.3  质谱条件  离子源为EI源，离子源温度为230 ℃，接口温度为250 ℃，溶剂延迟时间为2 min，扫描质量范围为60～550 amu。

1.2.4  乙醇粗提物的制备  称取300 g样品于4 L棕色玻璃瓶中，加入4 L 95%乙醇，超声2 h后浸泡48 h。浸泡液经过滤后收集滤液，减压蒸发，获得提取液浸膏置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.5  抑菌实验  本研究选取了3种重要的农业病原真菌为研究对象，分别考察胡椒蔓、叶提取物对其抑制作用，实验采用带毒平板法进行。预先将斜面培养基上的菌种复苏在PDA培养基上进行活化，得到接种菌落备用。无菌条件下分别称取不同量的蔓、叶浸膏，加入二甲基亚砜和吐温-80进行助溶，待PDA培养基冷却至45 ℃左右（不烫手）时，将定量体积的PDA培养基与浸膏溶液中轻轻混匀，使二甲基亚砜和吐温-80的体积浓度均为1.5%，提取物的梯度浓度分别为20、10、5、2.5、1.25 mg/L。迅速将混合培养基倒入培养皿中冷凝。选取培养平板上生长状况一致的菌落，用灭菌的打孔器（直径4 mm）平板环形打取菌饼，并将菌饼接种至上述带浸膏的平板上。每个浓度和菌株在平板中接种3个菌饼为平行实验。对照组除不加提取物浸膏外，其他条件与实验组一致。所有平板至于恒温培养箱中28 ℃培养。长到合适大小时用十字交叉法对每个菌落直径测量2次求直径平均，3个菌落再次取平均，计算抑制率，抑制率=（对照组菌落平均半径–实验组菌落平均半径）/对照组菌落平均半径×100%。根据提取物浓度和抑制率，使用SPSS 19.0软件求出毒力回归方程，并计算EC₅₀值等。

2  结果与分析

2.1化学成分

对胡椒蔓和胡椒叶进行GC-MS分析，方法一与方法二分别提取胡椒蔓和胡椒叶的总离子流见图1。从图1中可以看出，胡椒蔓和胡椒叶的化学成分非常复杂，经NIST标准谱库数据系统分析处理，均得到100多种组分，按照面积归一法确定各组分的相对百分含量，其中匹配度在90%以上的物质对应的化合物见表1和表2，2种方法提取胡椒蔓和胡椒叶中化学成分的相对含量见图2。由表1和表2可知，方法一与方法二提取胡椒蔓分别鉴定出34和14种化合物，提取胡椒叶分别鉴定出43和11种化合物。方法一（减压浓缩法）更能保留胡椒蔓和胡椒叶中大部分特征化合物。

由表1和图2A可以看出，胡椒蔓中主要化学成分是胡椒碱、烯类（如石竹烯、榄香烯、芹子烯）、酸酯类（如肉豆蔻酸、亚油酸乙酯）、

醇类（如3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、叶绿醇）、甾醇类（如菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇）及酮醛类等，其中胡椒碱占大多数，方法一和方法二中胡椒碱相对含量分别达到34.97%和34.06%。

由表2和图2B可以看出，胡椒叶中主要化学成分是烯类（如榄香烯、（+）-香橙烯、石竹烯、α-古巴烯、α-荜澄茄油烯、a-古云烯等24种化合物）、胡椒碱、醇类（如合金欢醇、橙花叔醇、斯巴醇等）、甾醇类（γ-谷甾醇）、酸酯类（如棕榈酸、香茅酸甲酯等）、酮醛类等，其中烯类化合物占大多数，方法一中相对含量达到28.84%，以δ-榄香烯最高，相对含量达到13.268%。

胡椒植株具有独特的辛香气味，这与其体内的化学成分具有重要的关系，特别是烯类、醇类和酸酯类化合物对其气味起着重要作用;而胡椒碱是胡椒具有辛辣味的主要来源之一。另外，有很多物质如石竹烯、榄香烯、α-荜澄茄油烯、胡椒碱、斯巴醇、香茅酸甲酯等具有抑菌的生物活性^[19-20]。此外，还有谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等甾体类可能在其生长过程中产生重要作用。

2.2提取物抑菌效果

实验结果表明，胡椒蔓和叶的提取物对这3种病原真菌生长均呈现出一定的抑制作用，不仅菌落扩展半径受到明显抑制而且菌丝密度显著降低，而且随着提取物浓度增加，抑制作用加强，呈现出良好的量效关系（图3，图4）。3种病原菌中，对番茄早疫病病原菌的抑制效果最为明显，2.5 mg/mL的胡椒蔓提取物对番茄早疫病病原菌的抑制即超过35%，而对灰葡萄孢菌和腐皮镰刀

菌的抑制效果相对较低，但效果仍然比较明显，浓度为10 mg/mL时对其抑制率分别为41%和36%。与胡椒蔓提取物相比，胡椒叶提取物的抑制作用更突出，2.5 mg/mL的叶提取物对番茄早疫病病原菌的抑制率即超过胡椒蔓提取物10 mg/mL的效果，达到55%。10 mg/mL的叶提取物对另外2种真菌的抑制率也超过了50%。实验结果表明，胡椒叶提取物对这3种病原真菌的抑菌效果比胡椒蔓好，这可能与其所含有的多种烯类化合物如榄香烯、石竹烯有关，文献报道这些成分具有明显的抗菌效果^[21-22]。表3中计算出了胡椒蔓和叶提取物对3种病原菌的毒力方程及EC₅₀值，线性相关度良好，其中蔓的浸提物对灰葡萄孢菌和腐皮镰刀菌的抑制效果相对较差，而且濃度效应不明显，因此其EC₅₀值的误差相对较大，故表中将其省略。

本研究所采用的3种病原菌是在农业生产中引起严重损失的重要种类，能够引起果树，蔬菜、花卉、茶叶等百余种作物的病害，造成较为严重的危害^[23-25]。实验结果表明，胡椒修剪所产生的废弃物所含的化学成分均能够起到较为明显的抑制作用，能够为植物病虫害的生物防治和绿色防控提供较为有效的研究材料，可以应用于有机食品及无公害农产品生产中的病虫害防控研究，同时，作为农田废弃物价廉易得，在农业生产中较为合适，具有较大的应用潜力和开发价值。

3  结论

本研究以胡椒修剪过程中产生的废弃物胡椒蔓和叶为研究对象，采用气相色谱-质谱联用技术分别对其乙醇提取物中化学成分进行研究。结果表明，其成分复杂，涉及化合物种类众多，不仅含有胡椒的多种特征性组分，而且还含有具有抗菌活性的挥发性物质。进一步将蔓和叶提取物添加到培养基中，考察其潜在的抗菌效果。通过对比实验，发现其对于包括番茄早疫病病原菌在内的3种重要的农业病原真菌具有较好的抑制作用。

随着绿色农业和可持续发展理念的推进，病虫害的绿色防控技术势在必行，这就需要开发大量的天然抗菌材料。本研究证明了胡椒废弃物具有较好的抗菌活性，具备成为抗菌天然材料的潜力。同时，胡椒在生产过程中需要定期进行枝条修剪，剪掉的部分通常被视为废弃物丢弃，长期大面积的种植会产生大量的枝蔓废弃物，造成资源的巨大浪费。本研究使用乙醇浸提的方法，操作简单，成本低廉，对环境无污染，适合在农业生产中应用，可以为作物病虫害生物防治和绿色农业的发展提供有效的材料。同时，这一理论研究符合农业“两减”的政策和目标要求，符合绿色和可持续农业的概念，具有潜在的开发和利用价值。

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