大庆油污土壤中石油降解菌的筛选和鉴定研究

程进

摘要：从大庆油井旁含油土壤中筛选出两株石油降解菌，经过形态观察和生理生化鉴定，最后16SrDNA鉴定。结果表明：C3J1-2為微小杆菌属（Exiguobacterium）、A3J1-1为不动杆菌属（Acinetobacter）。

关键词：石油降解菌;筛选;鉴定

石油在开采和运输过程中会发生储油罐泄漏、井喷、输油管道破裂等事故，或是含油废水排放、有害废泥浆排放等不良行为，导致大量石油及其产品污染土壤、破坏植被，严重威胁着生态系统的平衡和安全。[1]探索高效、经济的处理方法修复石油污染土壤，对于生态环境具重要意义。[2]生物修复技术具有环境友好、成本低廉、操作简便、对操作人员危害小、作用彻底等特点，越来越引起人们的重视，被广泛应用到环境污染治理领域。[3]本人从油井附近油污土壤中筛选出三株石油降解菌，经过鉴定其中C3J1-2为微小杆菌属（Exiguobacterium）、E1J4-1和A3J1-1为不动杆菌属（Acinetobacter）。前人关于微小杆菌属（Exiguobacterium）降解石油烃的论文较少。

1实验方法

1.1筛选

参照董丁[4]论文配置培养基《微生物学实验》[5]配置所需培养基，取2g从大庆油井附近采集的油污土，使用前一直置于-80℃环境。将土壤置于含油10%的100ml无机盐培养基中，并加入几颗玻璃珠，在160rpm、30℃条件下摇床震荡培养5d后，取10ml培养液转移转移到新的含油无机盐培养基中，160rpm、37℃条件继续摇床震荡培养5d，连续驯化传代5次。

取100μL培养液涂布于油平板上，置于37℃培养16h，挑取不同形态和颜色的单菌接种于含油培养基中，连续划线培养3次，直至镜检无杂菌，得到纯化菌株。分离出的菌株转接到石油固体培养基并生长良好，则认为该菌具有潜在的降解石油烃特性，即为待筛菌株。

1.2鉴定

观察三株细菌的菌落形态边缘、颜色和透明度等并做好记录，其次参照《微生物学实验》[6-7]进行细菌生理生化试验，最后依据《常见细菌系统鉴定手册》[8]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]对细菌进行鉴定。

1.316SrDNA鉴定

参照王立秀[10]研究，利用提取的细菌基因组DNA模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）对筛选出的石油降解菌的16SrDNA基因进行扩增。

2分析

2.1石油降解菌特征

通过观察得出：菌株C3J1-2菌落呈圆形、浅黄色、菌落正反面颜色差别不大、有异味、菌落中部凸起、表明光滑、湿润、有光泽、菌落不透明、边缘不整齐;菌株A3J1-1菌落呈圆形、乳白色、菌落正反面颜色差别不大、无异味、菌落中部凸起、表明光滑、湿润、有光泽、菌落不透明、边缘整齐。

2.2生理生化实验结果

菌株C3J1-2的革兰氏染色为阳性，接触酶试验阳性，氧化酶阴性，V-P实验阴性，好氧性为阳，硝酸盐为阳，甲基红试验为阴，明胶水解为阳，淀粉水解为阳，油脂水解为阴，石蕊牛奶试验为阴，吲哚试验为阳，葡萄糖发酵不产气;菌株A3J1-1革兰氏染色为阴性，接触酶试验阳性，氧化酶阴性，V-P实验阴性，好氧性为阳，硝酸盐为阴，甲基红试验为阴，明胶水解为阴，淀粉水解为阳，油脂水解阳，石蕊牛奶试验为阳，吲哚试验为阳，葡萄糖发酵不产气。

2.316SrDNA鉴定

将测得的16SrDNA序列提交至GenBank，下载同源性达97%以上的序列，用MEGA软件构建系统进化树。最终得出，鉴定C3J1-2为微小杆菌属（Exiguobacterium）、E1J4-1和A3J1-1均为不动杆菌属（Acinetobacter）。

3结论展望

最终得出，鉴定C3J1-2为微小杆菌属（Exiguobacterium）、E1J4-1和A3J1-1均为不动杆菌属（Acinetobacter）。本研究丰富了石油烃降解菌的研究，为石油污染的微生物修复提供了菌种资源和相关信息。可以深入进一步研究细菌的具体降解效果，未更好发挥细菌作用提供参考。

参考文献：

[1]曹云者，施烈焰，李丽和，李发生.石油烃污染场地环境风险评价与风险管理[J].生态毒理学报，2007（03）：265-272.

[2]汪洋.大庆油田石油污染土壤堆肥修复及微生物群落结构研究[D].东北农业大学，2017.

[3]涂书新，韦朝阳.我国生物修复技术的现状与展望[J].地理科学进展，2004（06）：20-32.

[4]董丁，卢彦珍，唐美华，陈国松.一株石油烃高效降解菌的筛选及降解性能研究[J].南京工业大学学报（自然科学版），2017，39（03）：58-62+89.

[5]陈敏.微生物学实验[M].杭州：浙江大学出版社，2011.6.

[6]程丽娟，薛泉宏.微生物学实验[M].北京：科学出版社，2012.

[7]程水明，刘仁荣.微生物学实验[M].武汉：华中科技大学出版社，2014.5.

[8]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2005.

[9]R.E布坎南，N.E.吉本斯，等.伯杰细菌鉴定手册（第八版）[M].北京：科学出版社，1984.

[10]王立秀，陈伟，谢桂林，周亮.阿南原，等.跳肠道细菌的分离鉴定及降解纤维素细菌的筛选[J].昆虫学报，2018，61（07）：835-842.