鸡传染性支气管炎病毒Real-Time PCR检测方法的建立

张会 赵鲁 连锐锐 张子越 赵晓月 潘力 李智勇

摘  要：本试验针对肾型鸡传染性支气管炎病毒（IBV-QX）保守基因N基因设计并合成引物，构建了阳性质粒标准品;经过不断优化建立了检测IBV-QX SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR标准曲线。结果显示，本次所建立的检测方法重复性好，特异性高，最低可检测到39.7copies/μl的病毒核酸，对常见禽源病毒无交叉反应。本次建立的方法不仅可以用于各基因型IBV病原检测，也可用于病毒的定量研究。因此，本实验室所建立的IBV检测方法在鸡传染性支气管炎病毒的快速检测上具有重要意义。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒;Real-Time PCR;病毒检测;荧光定量

中图分类号：S858.31     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2019）2-0020-04

传染性支气管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的高度接触传染性疾病，IBV属冠状病毒科冠状病毒属。IBV感染主要引起鸡的呼吸道、肾脏和生殖道病理变化，导致被感染鸡群发病而造成巨大经济损失[1]。IBV的不同血清型之间几乎没有交叉保护，不断出现新的IBV血清型是预防和控制IB的主要挑战[2]。调查显示，QX基因型IBV是我国近几年主要流行的毒株之一[3]，常规RT-PCR方法以其简单、快捷的特点被各实验室用作IBV的实验室诊断方法，但该方法不能用于IBV的定量检测，并且对病毒含量很低的病料也不能够很好地检出。为此，建立一种特异性高、重复性好、敏感性高的IBV实验室检测方法将有助于鸡传染性支气管炎疫情的防控，从而将损失将至最低。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  病毒株  IBV-QX毒株由山東省农业科学院家禽研究所山东省禽病诊断与免疫重点实验室惠赠。

1.1.2  试验动物  9日龄 SPF鸡胚购自山东昊泰实验动物繁育有限公司，用于病毒复苏。

1.1.3  试验试剂与主要试验仪器  琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒、体液病毒DNA/RNA提取试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司;荧光定量试剂盒、反转录体系试剂购自山东赛恩斯科技有限公司;DL-2000Marker、2xTaq PCR Star Mix、感受态细胞、pMD18-T载体、质粒小提试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪均购自杭州博日科技有限公司;Real-Time PCR仪（LightCycler 96）购自德国罗氏诊断有限公司;紫外凝胶成像仪（Alpha Imager HP）购自美国Protein Simple公司;干式恒温器、紫外透射反射分析仪、自动核酸提取仪购自西安天隆科技有限公司;超微量分光光度计（K5600）购自南京旭析仪器有限公司。

1.2  试验方法

1.2.1  SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR引物的设计与阳性质粒标准品的制备  根据IBV-QX的N基因序列（GenBank 中登录号为AY761141.1）。利用primer premier6.0软件设计了引物。引物：上游5'-GTA GCC TGG AAA CGA ACG G -3'，下游，5'-TCC TAG TGC TGT ACC CTC GG -3'，片段大小186bp，引物由青岛英赛特生物科技有限公司合成。采用TaKaRa公司生产的反转录试剂盒将所提核酸反转录成cDNA，反应体系20μl，1μl通用引物（50 pmol/μl）、4μl模板，其他反转录成分按照试剂盒说明使用;反转录条件：25℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 5min。将获得的cDNA进行常规 PCR扩增。PCR反应体系25μl，上、下游引物各0.4μl（20 pmol/μl），2μl模板，用ddH2O补至25μl，其他成分按照说明书加入。PCR反应条件：预变性95℃ 2min;变性95℃ 30s;退火55℃ 30s;延伸72℃ 45s;共33个循环;重延伸72℃ 10min。将PCR产物进行电泳，按照琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒说明回收目的片段，将回收的目的基因连接转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，过夜培养，挑单菌落，进行阳性鉴定，将阳性单菌落摇菌提质粒，并将所提质粒送生物公司测序。

1.2.2  IBV-M41 SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR标准曲线建立  采用超微量分光光度计（K5600）测定所提质粒浓度。根据相关公式计算其相应拷贝数[4]。将所得质粒梯度稀释后按照以下体系与反应条件：反应体系为20μl，Mix 10μl、ddH2O 7.2μl、上、下游引物各0.4μl、模板2μl。预变性95℃ 120s;变性95℃ 15s;退火55℃15s;延伸72℃ 25s;溶解曲线跟随仪器自设系统，45个循环，设置三个空白对照，仪器自动采集荧光信号，空白对照为阴性时，结果可信。

1.2.3  敏感性试验  将IBV-QX的阳性质粒标准品进行10倍梯度稀释，稀释至测定荧光定量PCR仪所能检出的最低浓度，并同时进行普通PCR方法检测，比较二者的敏感性。

1.2.4  特异性试验  取H9N2亚型禽流病毒（AIV-H9N2）、禽偏肺病毒（APV）、鸡传染性贫血病毒（CAV）、新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡毒支原体（MG）、禽白血病病毒（ALV）和IBV-QX的cDNA按本试验优化好的方法同时进行Real-Time PCR检测，以检验所建立的标准曲线的特异性。

1.2.5  重复性试验  批间重复性试验： 取6个10倍梯度稀释的阳性质粒标准品在同一条件下进行3次独立的Real-Time PCR检测。

批内重复性试验：取6个10倍梯度稀释的阳性质粒标准品，每个梯度3个重复，进行Real-Time PCR检测。

2  结果与分析

2.1  普通PCR鉴定重组质粒结果  将构建的标准质粒进行普通PCR扩增、电泳，目的核酸片段大小为186bp。见图1。

2.2  标准曲线建立与其灵敏度和特异性验证结果

2.2.1  标准曲线的灵敏度  此次Real-Time PCR标准曲线最低可检测到39.7copies/μl的病毒cDNA，比普通RT-PCR灵敏度高出100倍，目的核酸片段大小为186bp。结果见图2。

2.2.2  扩增曲线的重复性  由结果统计分析得出，批间变异系数（CV）小于1.5%，批内变异系数（CV）小于0.6%，重复性良好，符合试验要求。结果见图3。

2.2.3  标准曲线的特异性  所取AIV-H9N2、APV、CAV、NDV、IBDV、ILTV、MG、ALV和IBV-QX的核酸按本试验优化好的方法同时进行Real-Time PCR检测，除了IBV-QX外的其它病毒cDNA 对应孔均未出现熔解曲线，证明本次建立的Real-Time PCR检测方法的特异性强，符合试验要求。结果见图4。

2.2.4  標准曲线相关参数  测得质粒浓度为：128ng/μl，OD260/230=2.53，OD260/280=1.80，计算得出其原始拷贝数为3.97×1010copies/μl;不断优化试验方法后建立了对应的标准曲线：Y=-3.7924x+38.32，R2=1.0，Efficiency=2.01，Error=0.35，各项数据均符合试验要求。

3  讨论

最新流调表明，目前QX基因型IBV已占我国流行毒株的70%左右，由于RNA聚合酶缺乏校正能力，使得IBV极易发生变异，新的血清型和基因型不断出现，不同毒株之间免疫交叉保护并不理想[5-6]。基于以上客观原因，本实验室经过不断优化试验条件，建立了IBV SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR的检测方法，通过以上试验结果可以得出：与传统RT-PCR检测方法相比，Real-Time PCR法灵敏度更高，这对养殖场早期鸡传染性支气管炎病毒的防控具有重要意义，同时，本实验室根据IBV保守基因设计引物而建立的检测方法，可用于不同基因型、血清型的IBV病毒定量检测和被感染动物相关器官病毒载量研究。

参考文献：

[1]  Cook J K， Jack wood M， Jones R C. The long view：40 years of infectious bronchitis research.[J]. Avian Pathology， 2012， 41（3）：239-250.

[2]  Cavanagh D. Coronavirus avian infectious bronchitis virus[J].Veterinary Research， 2007， 38（2）：281.

[3]  陈良珂，封柯宇，李鸿鑫，等.2013～2017年鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学分析[J].中国家禽，2018，40（15）：16-20.

[4]  刘乔然，刘胜旺.鸡传染性支气管炎病毒Real-time PCR方法的建立及其对感染鸡体内病毒的检测[J].中国预防兽医学报，2008，30（8）：36-41.

[5]  Han Z， Sun C， Yan B， et al. A 15-year analysis of molecular epidemiology of avian infectious bronchitis coronavirus in China[J].Infection Genetics & Evolution， 2011，11（1）：190-200.

[6]  Benyeda Z， Szeredi L， Mató T， et al. Comparative histopathology and immunohistochemistry of QX-like，Massachusetts and 793/B serotypes of infectious bronchitis virus infection in chickens[J].Journal of Comparative Pathology， 2010， 143（4）：276-283.