啤酒活性干酵母凝血质提取研究

田小海 王莘

摘要 [目的]研究并优化啤酒活性干酵母凝血质的提取工艺。[方法]生长曲线法确定其培养时间，采用L9（34）正交试验设计，应用低温和葡聚糖凝胶（SephadexG-75）对凝血质进行纯化。[结果]啤酒活性干酵母最佳培养时间为9 d，凝血质提取优化工艺参数为乙醇浓度85%、提取温度35  ℃、第1次丙酮体积（丙酮∶粗提液）为0.7、恒温磁力搅拌器转数为600 r/min，凝血质提取量可以达到1 000 mL活化液0.660 g，纯化率为13%。[结论]从啤酒活性干酵母可提取凝血质，方法简单易实现，降低凝血质动物来源的生成成本，具有极大的应用价值。

关键词啤酒活性干酵母;凝血质;提取;纯化

中图分类号TS262.5+4文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）03-0147-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.047

凝血系统是人体发挥内源性或外源性凝血途径的物质基础，凝血物质一般可分为经典凝血和激肽2个系统[1]。凝血质属于经典凝血系统中的凝血因子Ⅲ，当凝血因子Ⅲ与其受体Ⅶa结合后，可通过启动外源性凝血途径而发挥凝血作用[2]。

凝血质来源较为广泛，主要有中药、动物和微生物等。前人的研究主要集中在2种来源的凝血质的提取，一种是从中药中进行凝血质分离和提取，另一种是从试验动物的血液中进行提取和纯化。中药来源的凝血质分离提取过程复杂、纯化困难，获取量少限制了其应用;动物源性的凝血质为优质凝血质，但难于从动物体内大量获得，试验动物获取凝血质生产成本较高，也限制了其应用;微生物来源的凝血质主要存在于半知菌纲的真菌中，啤酒活性干酵母中凝血质含量丰富，容易扩大培养，分离提取及纯化工艺相对容易，是获得凝血质的理想来源，但微生物来源的凝血质的提取研究较少。笔者主要通过对啤酒活性干酵母的生长曲线的测定确定凝血质提取的时间，通过醇浸提，脱水后乙醚提取，再通过丙酮沉淀的方法进行研究，达到优化提取方案的目的。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种。湖北安琪酵母公司提供安琪啤酒活性干酵母。

1.1.2试剂。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、铁粉、琼脂、蒸馏水、不同浓度的乙醇、无水硫酸钠、乙醚、丙酮、考马斯亮蓝G-250、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、二巯基乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、盐酸、甘氨酸、磷酸盐缓冲溶液等。

1.1.3仪器。高压蒸汽灭菌箱、光照培养箱、无菌操作台、恒温水浴箱、多循环水式真空泵、恒温磁力搅拌器、摇床、离心机、分析天平、摇床、pH计、旋转蒸发仪、冷冻干燥机、分光光度计（可见光和紫外光）、冰箱、超声波振荡器、电泳仪、Sephadex G-75。

1.1.4培养基。

活化培养基[3]：葡萄糖2.5 g、蒸馏水100 mL，121.3 ℃，103.4 kPa，灭菌20 min。

斜面培养基：葡萄糖40 g、蛋白胨和琼脂各10 g、酵母膏5 g，加水至500 mL，121.3 ℃，103.4 kPa，灭菌20 min。

液体发酵培养基[4-5]：葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 2 g、微量Fe粉，加水至500 mL，121.3 ℃，103.4 kPa，灭菌20 min。

1.2方法

1.2.1啤酒活性干酵母活化和扩大培养[4-6]。

1.2.1.1菌种活化。2.5 g葡萄糖置于250 mL三角瓶中，加水100 mL，溶解后于电炉加热煮沸，冷却至35 ℃，即得活化液，121.3 ℃，103.4 kPa，灭菌20 min。啤酒活性干酵母0.2 g，35 ℃条件下加入活化液中，自然冷却至30 ℃后，置于30 ℃水浴中活化2 h。

1.2.1.2斜面保存。取活化后菌种，在无菌操作台进行斜面接种，培养7 d，冷藏保存备用。

1.2.1.3扩大培养。取适量冷冻保存的菌种，接入40 mL（250 mL三角烧瓶）液体发酵培养基中，于28～30 ℃摇床振荡（150 r/min）培养24 h，可用于凝血质的提取分离。

1.2.2啤酒活性干酵母生长曲线的测定[7]。

250 mL活化液分别对生长1～12 d的啤酒活性干酵母进行测定，从培养24 h后开始，每间隔24 h收集一次菌体，由于离心效果差，采用静置沉降的方法收集菌体[8]，测定前采用200目筛网对发酵液进行过滤，50 ℃以下对过滤得到的菌体进行烘干处理后进行称重，根据称重结果以发酵天数为横坐标、干菌体量为纵坐标绘制曲线，即为生长曲线。

1.2.3啤酒活性干酵母凝血质的提取方法[9]。

啤酒活性干酵母干菌体在一定温度下，通过一定浓度的乙醇浸提，获得提取液;提取液在一定温度下经过浓缩，获得膏状物;膏状物经无水硫酸钠脱水后，再经過乙醚提取，获得乙醚提取液;乙醚提取液进行浓缩，获得浓缩物;浓缩物经丙酮沉淀后，获得凝血质粗品。250 mL活化液对乙醇浓度、提取温度、转速、丙酮浓度影响因素采用正交试验L9（34） 确立最佳提取条件。

1.2.4啤酒活性干酵母凝血质的纯化方法[10]。

除去脂类物质，如麦角固醇、卵磷脂等可以采用乙醚挥发和低温沉淀除去。

准确称取SephadexG-75 2.0 g置于烧杯中，加入250 mL双蒸水溶胀48 h;取直径为2 cm、高60 cm层析柱，关闭出口后加入5 mL磷酸盐缓冲溶液，缓慢加入溶胀好的凝胶颗粒，同时打开出口使其缓慢沉积。缓慢注入磷酸盐缓冲溶液，达到柱平衡后将溶解在磷酸盐中的凝血质粗品溶液缓慢加入凝胶柱，不断用磷酸盐缓冲溶液洗脱，同时收集洗脱液进行干燥处理，即可得到纯化的凝血质。

2结果与分析

2.1啤酒活性干酵母活化及扩大培养结果

啤酒活性干酵母经活化后保存的菌种接种于活化液12～16 h即可获得较多菌体，为了便于试验过程的进行，一般培养24 h后开始使用菌体。

2.2啤酒活性干酵母的生长曲线

对培养1～12 d的啤酒活性干酵母设定3个重复，分别烘干菌体后取平均值，根据具体的干菌体量制作其生长曲线见图1。

凝血质是啤酒活性干酵母生长繁殖过程中的初级代谢产物。因此，随着菌体生成量的增多，凝血质的产量也随之增加，其凝血质提取的最佳时期为8～10 d[11]，试验中确定第9天啤酒活性干酵母菌量最多，250 mL活化液最多可获得1.27 g干菌量。

2.3啤酒活性干酵母凝血质的提取

通过正交试验结果（表2）分析，各项影响因素的最佳水平组合为A2B2C2D1，即乙醇浓度为85%、提取温度35 ℃、搅拌器转数600 r/min、丙酮浓度为70%。4种影响因素的重要性排序为A>B>D>C，即乙醇浓度最重要，其次为提取温度，再次为丙酮浓度，最后为搅拌器转数。

优化工艺后采用85%乙醇、35 ℃、600 r/min、丙酮浓度为70%的条件下再次提取粗品凝血质的量为0.165 g。1 000 mL活化液提取凝血质粗品量达0.660 g。

2.4啤酒活性干酵母凝血质的纯化

2.4.1啤酒活性干酵母凝血质除脂类物质。

将凝血质粗品置于-14 ℃冰箱中过夜，即可除去凝血质粗品中含有的少量麦角固醇和卵磷脂，使用冷冻干燥机可迅速干燥。

2.4.2啤酒活性干酵母凝血质经葡聚糖凝胶纯化。

将0.660 g粗品凝血质经SephadexG-75可纯化为凝血质成品，可获得纯化的凝血质0.085 8 g，使得啤酒活性干酵母纯凝血质的纯化率达13%。

3讨论与结论

3.1啤酒活性干酵母的培养

对啤酒活性干酵母的培养也尝试利用酒糟中的成分以及糖厂的废糖蜜等作为培养基进行培养。可以通过正交试验确定蛋白饲料水、DDGS水、废糖及酵母泥的最佳配比[12]，在培养原料上节省资源，便于扩大培养和投入实际生产。但由于培养的效果没有达到预期，因此，该试验中仍然采用了经典的酵母菌培养的培养基，培养条件简单，酵母菌对培养基中的营养成分要求不高，仅在大量培养时消耗大量的葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等成分。

3.2啤酒活性干酵母生长曲线的测定

由于凝血质为啤酒活性干酵母生长繁殖过程中产生的初级代谢产物，因此，菌体的量越多，所含有的凝血质越多，测定其生长曲线非常必要。对啤酒活性干酵母生长曲线的测定可以采用干法或湿法2种测定方法。由于湿法测定中对于发酵液过滤的效果不能完全一致，因而导致测定结果不够准确。但采用干法测定时，一定保证在烘干处理过程中温度不能太高，否则会破坏蛋白质的生物活性，导致其出现热变性，因此温度要严格控制在50 ℃以下。

3.3凝血质提取过程中各种试验因素的影响

培养后获得的啤酒活性干酵母细胞壁的破坏可以采用多种方法处理，可以采用破壁效果较好的破壁机处理，效果较好;采用超声波破碎会使得细胞壁破坏不均匀，严重的会破坏细胞内蛋白成分，轻微的又不能起到破壁作用，效果不好;研钵研磨仅适合实验室的小规模试验，不适合扩大生产。因此，该试验采用破壁机处理。

乙醇浓度过低（75%）浸提效果不好，浓度过高，会产生大量的难于与蛋白质分离的物质，且会造成乙醇的浪费。提取的温度过低，不利于凝血质的释放，温度过高，容易造成凝血质的部分活性的破坏或丧失。一次丙酮浓度过高会造成浪费，但如果浓度过低则会导致其中残留的乙醚无法彻底除去。磁力搅拌器转子的转数高低的影响较小，但如果转数过高容易造成温度升高，要采用恒温磁力搅拌器处理。因此，凝血质提取过程中各种试验影响因素的具体参数为：乙醇浓度85%;提取温度35 ℃;一次丙酮浓度70%;转数为600 r/min。

3.4凝血质提取及纯化比较

啤酒活性干酵母发酵9 d干菌体量达1.270 g/250 mL活化液，凝血质的提取量为0.165 g/250 mL活化液，提取率达12.992%，与文献[13]中的提取率提高5百分点;纯化后凝血质量为0.215 g/250 mL，纯化率达13%，与文献[13]中的纯化率提高4百分点。因此，试验达到了提取优化和纯化改进的效果。

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