稻瘟病菌Fbox蛋白MoFbr7生物学功能分析

张梦园 潘锐 谭乐勇 郭敏

摘要Fbox蛋白在泛素蛋白酶体途径（ubiquitinproteasome pathway，UPP）中参与调控胞内蛋白降解、受体识别、信号传导等生物学过程。本研究从稻瘟病菌中克隆了Fbox基因MoFbr7，序列分析表明，该基因编码产物具有1个Fbox结构域（N端）和8个连续的WD40重复序列（C端），在丝状真菌中高度保守。利用基因敲除方法，获得4个MoFbr7基因敲除突变体，同时构建了回补菌株。表型分析结果显示，MoFbr7基因缺失突变体在产孢量、附着胞形态、原生质体释放、致病性等方面均无异常。突变体在MM、RDC培养基上生长速率下降;对细胞壁胁迫因子CFW（Calcofluor white）、刚果红敏感。以上结果表明MoFbr7参与稻瘟病菌的营养生长与细胞壁完整性，为进一步揭示其生物学功能奠定基础。

关键词稻瘟病菌;Fbox蛋白;基因敲除;功能分析

中图分类号：S 435.111.41

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018135

稻瘟病菌Magnaporthe oryzae是引起稻瘟病的病原菌，对全球水稻产量及品质造成严重威胁[1]。十几年来，世界各国科学家已对稻瘟病菌进行了全面系统的研究，为稻瘟病菌作为分子生物学模式生物研究植物病原真菌致病机理打下坚实的基礎[23]。

Fbox蛋白广泛存在于真核生物中，在细菌和蓝藻中也有发现[4]。该蛋白最先在人体中被发现并被鉴定为泛素连接酶复合物（Skp1Cullin1Fbox，SCF）的底物识别亚基[5]，在泛素蛋白酶体途径中不可或缺[6]。有研究表明，SCF复合体可以在植物中合成，可能控制多种代谢途径中涉及的数百个底物的稳定性[7]。另外，Fbox蛋白在不同物种中数量差距悬殊。全基因组重复（whole genome duplication，WGD）可大大增加Fbox基因的数量。基因丢失在WGD后迅速发生[8]，不同物种的不同基因丢失率也会导致Fbox基因数量波动[9]，还有一些植物可能倾向于消除冗余基因，确保在特定环境条件下生存[10]。Fbox蛋白不仅含有Fbox基序，还包括其他结构域[11]，如WD40（tryptophan aspartic acid 40）重复域、富含亮氨酸的重复域（leucinerich repeat，LRR）、FBD结构域（FBox and BRCT domain）、PAS 结构域（Per Arnt Sim）、PPR结构域（pentatricopeptide repeat）、TUB结构域（tubby）、Kelch 结构域（Kelch repeats）[12]和环指结构域（really interesting new gene，RING finger）等。

近年来，在真核生物中，已经鉴定出许多Fbox基因与细胞凋亡、细胞器的发生、DNA的转录和修复、核糖体的合成等生命活动密切相关[1314]。有研究表明，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的Grr1在细胞周期中不可或缺[15]。为探究Grr1在稻瘟病菌中的同源物是否也具有类似功能，本文对稻瘟病菌中同源物MoFbr7且含有Fbox结构域的基因进行初步功能分析，有助于了解MoFbr7对稻瘟病菌的调控机制。

1材料与方法

1.1材料

稻瘟病菌野生型菌株 Guy11、酵母菌株FY834、大肠杆菌Escherichia coli菌株DH5α、农杆菌Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105均由本研究室保存。MoFbr7敲除及回补菌株在本研究中获得，采用滤纸片法保存于-20℃。

水稻感病品种‘CO39和大麦品种‘Golden Promise均保存于本真菌研究室。

1.2MoFbr7蛋白序列的获得与分析

在数据库（https：∥genome.jgi.doe.gov/programs/fungi/index.jsf）中获得酿酒酵母菌中Grr1的氨基酸序列，然后在稻瘟病菌中进行Blastp分析，找到22个同源基因。本文将其中一个含有Fbox结构域的基因MGG_06372.6（Fbox/WD repeatcontaining protein 7）命名为MoFbr7，并对其序列保守性进行了分析。对数据库中获取的MoFbr7氨基酸序列，利用SMART工具对其结构域进行分析。于NCBI网站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中使用Blastp搜索工具获得其他同源物序列。用BioEdit和MEGA 7.0软件对MoFbr7和其他序列进行比对并构建系统进化树。

1.3MoFbr7基因敲除及回补载体的构建及转化

根据数据库提供的基因组序列，以稻瘟病菌菌株Guy11的基因组DNA为模板，使用GL547（F）/GL548（R）和GL549（F）/GL550（R）分别扩增MoFbr7上下游各1.0 kb左右的片段。将上下游片段与潮霉素磷酸转移酶基因（HPH）片段混合，利用酵母同源重组的方法整合到经SalⅠ酶切的ps110载体上，从而获得敲除载体ps110：：MoFbr7：：HPH。

设计引物GL1168（F）/GL1169（R）扩增包括MoFbr7基因的全长片段，连接至ps1102载体（含有萎锈灵抗性基因CBX）上，构建成为回补载体ps1102：：MoFbr7c：：CBX。通过农杆菌的方式将ps110：：MoFbr7：：HPH整合于Guy11菌株，并使用200 μg/mL潮霉素筛选;将ps1102：：MoFbr7c：：CBX整合于ΔMoFbr7并使用50 μg/mL CBX抗性筛选。所用引物序列见表1。

1.4MoFbr7基因敲除及回补转化子的鉴定

提取所有转化子基因组，用上游臂外引物和HPH片段上引物GL1381（F）/GL557（R）进行PCR检测，可扩增出1 993 bp条带，且用下游臂外引物和HPH上引物GL558 （F）/GL1382（R）可扩增出2 264 bp条带的转化子为待定的敲除突变体。提取所有待定转化子及野生型总RNA，反转录合成cDNA。进一步利用GL1460 （F）/GL1461（R）对其进行RTPCR分析检测，不能得到555 bp产物的菌株，则为敲除突变体;回补转化子中得到555 bp产物的则为回补菌株，以Actin扩增结果为对照。所用引物序列见表1。

1.5MoFbr7突变体的表型分析

1.5.1营养生长

从ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌落边缘切取边长为2 mm的正方形菌块，分别接种于CM（complete medium）、OM（oatmeal medium）、MM（minimal medium）及RDC（rice medium）培养基上，置于28℃培养，7 d后观察菌落生长形态并测量直径。

1.5.2产孢

从ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌株菌落边缘切取菌块，接种于RDC产孢培养基中，置于28℃恒温箱中培养6 d，转于40 W 黑光灯下诱导产孢，3 d后，分别用4 mL灭菌水洗涤供试菌株，收集分生孢子，并在显微镜下观察孢子形态与数量。

1.5.3附着胞形成

分别收集各个菌株的孢子并将浓度稀释为5×104个/mL。滴于疏水玻片以监测附着胞的发生，25℃避光培养。分别于2、4、8、12、24 h 显微镜下监测附着胞发生情况。

1.5.4大麦侵染测定

剪取大麦叶片，背面朝上贴于保湿盒，分别收集各个菌株的孢子并将浓度稀释为2×104个/mL，于24、36、48 h统计附着胞侵入情况。

1.5.5致病力检测

分别将ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌株的孢子浓度稀释为5×104个/mL，利用喷雾器将其喷洒于14 d水稻叶片上。28℃暗培养24 h后进行L∥D=12 h∥12 h光暗交替培养，7 d后观察叶片发病情况并拍照。

1.5.6对胁迫因子的敏感性测定

从活化后的ΔMoFbr7、MoFbr7c及Guy11菌株的菌落边缘切取菌块，接种于含200 μg/mL Calcofluor white （CFW），200 μg/mL刚果红（CR），0.7 mol/L NaCl，3 mmol/L H2O2、0.01% SDS、1.2 mol/L山梨醇及无药剂的CM平板中，置于28℃，黑暗培养。5 d后拍摄菌落生长情况并测量菌落直径，计算抑制率。

1.5.7原生质体释放观察

切取ΔMoFbr7、MoFbr7c及野生型菌株边缘菌块于CM液体培养基中，28℃，165 r/min液体培养，2 d后过滤并压干水分，各称取100 mg菌丝体，分别置于浓度为7.5 mg/mL的10 mL Lysing enzyme酶解液中，每隔0.5 h，用血球计数板监测原生质体释放量，共计3个时间段。

2结果与分析

2.1MoFbr7生物信息学分析

于SMART网站中预测MoFbr7的结构域，发现在其N端（第142至183位）存在一个典型的Fbox结构域，同时在其C端（第272至592位）存在8个连续的WD40序列（图1），说明这是一个典型的Fbox基因。同源蛋白比對发现，MoFbr7与炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、球孢白僵菌Beauveria bassiana的同源性高达77%、75%、73%，而与人类Homo sapiens的同源性仅为28%（图2）。以上表明，MoFbr7蛋白在丝状真菌中具有较高保守性。

2.2基因敲除及回补突变体的获得

构建MoFbr7基因敲除盒（图3），PCR验证MoFbr7敲除及回补转化子。结果显示转化子ΔMoFbr71、ΔMoFbr73、ΔMoFbr74和ΔMoFbr75分别由GL1381（F）/GL557（R）扩增得到1 993 bp的条带;由GL1382（F）/GL558（R）扩增得到2 264 bp的条带;进一步RTPCR分析检测，使用内引物GL1460（F）/GL1461（R）不能够在敲除突变体中扩增出555 bp的条带，而在MoFbr7c中能扩增出555 bp条带（图3），说明成功获得了4个具潮霉素抗性的基因功能缺失转化子ΔMoFbr71、ΔMoFbr73、ΔMoFbr74和ΔMoFbr75和1个基因回补菌株MoFbr7c。

2.3MoFbr7表型鉴定

2.3.1营养生长

ΔMoFbr7在CM、OM平板上的生长速率正常;但在MM和RDC平板上，ΔMoFbr7菌株生长速率分别降低7.58%和10.38%（图4），说明ΔMoFbr7参与调控稻瘟病菌对部分营养物质的利用。

2.3.2产孢量

在RDC培养条件下，进一步分析ΔMoFbr7的产孢情况。结果显示，ΔMoFbr7分生孢子形态没有异常（图5a），附着胞形态也与野生型菌株一致（图5b）。另外，ΔMoFbr7的孢子形成量也未受到影响（图5c）。表明MoFbr7与分生孢子的形成及附着胞发育没有重要关系。

2.3.3突变体分生孢子对大麦表皮的侵染

于24 h时撕取处理过的大麦表皮，发现ΔMoFbr7的侵入栓形成没有异常。36 h后发现突变体成功侵入到表皮细胞内并分化形成侵染菌丝，侵入率与野生型相当，且菌丝分化程度也与野生型基本一致（图6a），48 h时ΔMoFbr7菌丝能正常扩展数据未展示。表明MoFbr7在侵染过程中不起关键作用。

2.3.4致病性

进一步将收集的ΔMoFbr7孢子喷洒于水稻叶片，7 d后观察到所有叶片上产生典型病斑，数目与形态皆与野生型无区别（图6b）。可见，MoFbr7基因与其对水稻的毒力不相关。

2.3.5对胁迫因子的敏感性及原生质体释放

在补充了各种类型胁迫因子的CM培养基上培养MoFbr7突变体和Guy11菌株，评估MoFbr7突变体对渗透压和氧化应激的敏感性。结果显示，在含有CFW和CR的培养基上，ΔMoFbr7抑制率较野生型分别高12.3%和10.5%（图7a～b）。结果表明，MoFbr7基因的缺失可能使稻瘟病菌的细胞壁组分发生变化。进一步原生质体释放观察显示，突变体的原生质体释放量与野生型无异（图7c）。

3小结与讨论

酿酒酵母中Grr1参与细胞对营养的摄取，并且影响蛋白降解，进一步调控细胞周期[15]。本研究室在前期试验中发现，稻瘟病菌中Mofbox参与营养生长、产孢、附着胞形成，同时影响对寄主的毒力[16]。Mogrr1影响菌株的生长速率、黑色素沉着、分生孢子梗的形成、对外源胁迫因子耐受性及对水稻的毒力[17]。

本研究对一个新的Fbox基因MoFbr7进行鉴定，该基因的生物信息学结果表明，其编码产物具有1个典型的Fbox结构域和8个连续的WD40结构域，并在丝状真菌中具有高度保守性。作为Fbox蛋白的一种，WD40蛋白被鉴定涉及细胞周期中的多种功能。在稻瘟病菌中，WD40重复蛋白MoCreC影响碳分解代谢阻抑（carbon catabolite repression，CCR）并且涉及稻瘟病菌的分生孢子、生长和致病性[18]。因此，MoFbr7基因具有参与调控对寄主毒力的可能性。

进一步表型分析结果表明，稻瘟病菌MoFbr7突变体在产孢量、分生孢子形成及对寄主致病性与野生型菌株没有显著差异，这可能来源于基因功能冗余的原因。突变体在CM和OM培养基中与野生型无显著差异，而MM培养基及RDC培养基中呈现菌丝生长速率下降，说明MoFbr7可能参与稻瘟病菌营养生长且对部分营养物质的利用与酿酒酵母中Grr1参与营养物质摄取这一结果相吻合。此外，ΔMoFbr7对细胞壁胁迫因子敏感，表明MoFbr7敲除突变体细胞壁组分可能发生变化。但是细胞壁的变化并没有影响ΔMoFbr7在裂解酶处理下的原生质体释放量，说明这种变化可能只是微弱的，对细胞壁完整性的影响不大。在玉米黑粉菌Ustilago maydis中，pmt4和Kre2被发现对细胞壁胁迫因子敏感，但致病性分析显示，仅有pmt4参与发病[19]。由此可见，轻微的细胞壁完整性改变并不是致病的关键因子，这可能是MoFbr7对CFW和CR敏感但最终不致病的原因。

综上所述，本文通过基因敲除方法对MoFbr7的生物学功能进行分析，对于其参与菌丝生长发育、调控细胞壁完整性及其他信号通路的分子机制，还待进一步研究。

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（责任编辑：田喆）