培养基配比对‘金踯躅’茎段组培和试管苗生根的影响

田晓玲，刘广超， 何 娇，路登宇，黄承玲，①

(1.贵州民族大学人文科技学院，贵州贵阳550025；2.贵州思源农旅综合开发有限公司，贵州盘州553537)

‘金踯躅’(Rhododendronmolle‘Jinzhizhu’)是园林绿化植物中不可多得的黄色杜鹃花品种，由羊踯躅(Rhododendron molleG. Don)实生苗开花植株经芽变选育获得，‘金踯躅’的花冠金黄色，与羊踯躅的纯黄色花冠有明显区别。 该品种无种子繁殖体，并且扦插繁殖困难。 目前，有关羊踯躅的繁育研究主要集中于繁殖生物学以及扦插和压条方法等方面[1]，[2]1-4，[3]3-16，[4]，但对羊踯躅组培快繁的研究较少[2]4-8，不利于羊踯躅及其品种的繁殖和推广应用。 作者以‘金踯躅’茎段为外植体，对诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中的激素种类和浓度以及增殖培养基中的蔗糖浓度进行筛选，以期建立稳定、高效的‘金踯躅’离体再生体系，为该品种的规模化繁育及稳定生产奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试‘金踯躅’栽培苗取自中国科学院昆明植物研究所植物园。 于2016 年6 月初剪取长7～10 cm 的‘金踯躅’当年生枝条，切成带1 或2 个腋芽的茎段，用体积分数75%乙醇漂洗20 s、无菌水冲洗3～5 遍，再用质量体积分数0.1%氯化汞消毒5～8 min、无菌水冲洗3～5 遍，作为外植体备用。

1.2 方法

1.2.1 诱导培养基中激素配比及培养 通过预实验确定WPM 培养基(含6.5 g·L-1琼脂，pH 5.6)为基本培养基，添加30 g·L-1蔗糖以及不同浓度的细胞分裂素和生长素组合。其中，细胞分裂素为1.0 mg·L-16-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、1.0 mg·L-12-ip (异戊烯基腺嘌呤)和1.0 mg·L-1KT(激动素)；生长素为0.1 mg·L-1NAA(萘乙酸)、0.1 mg·L-1IAA(吲哚乙酸)和0.1 mg·L-1IBA(吲哚丁酸)，采用完全随机实验设计，共设置9 个处理组；每处理组10 瓶，每瓶接种3 个茎段。 于温度20 ℃～23 ℃、空气相对湿度50%～60%、光照度1 500～1 800 lx、光照时间8 h·d-1的条件下培养30 d；统计分化出不定芽的茎段数，按照公式“分化率=(分化出不定芽的茎段数/接种茎段数)×100%”计算分化率，并据此确定适宜的诱导培养基。

1.2.2 增殖培养基配比的正交试验 采用L9(34)正交试验设计，设置3 因子分别为2-ip 浓度、NAA 浓度和蔗糖浓度，其中，2-ip 浓度分别为0.5、1.0 和1.5 mg·L-1，NAA 浓度分别为0.05、0.10 和0.15 mg·L-1，蔗糖浓度分别为20、30 和40g·L-1，共设置9 个处理组；每处理组10 瓶，每瓶接种3 个不定芽。 在WPM 培养基中按上述正交试验设计分别添加2-ip、NAA 和蔗糖，并按照上述条件培养30 d，统计试管苗数，按照公式“增殖率=(试管苗数/接种不定芽数)×100%”和“增殖倍数=试管苗数/出现试管苗的不定芽数”计算增殖率和增殖倍数，并据此确定适宜的增殖培养基。

1.2.3 生根培养基中激素配比及培养 在含有30 g·L-1蔗糖的WPM 培养基中分别添加NAA(浓度分别为0.10、0.50和1.00 mg·L-1)、IBA (浓度 分别为0.10、0.50 和1.00 mg·L-1)和NAA-IBA(NAA 和IBA 浓度均分别为0.05、0.25和0.50 mg·L-1)，共设置9 个处理组；每处理组10 瓶，每瓶接种3 株试管苗。 按照上述培养条件培养30 d，统计生根苗数，按照公式“生根率=(生根苗数/接种苗数)×100%”计算生根率，并据此确定适宜的生根培养基。

1.3 数据处理和分析

采用EXCEL 2007 和SPSS 16.0 软件对实验数据进行统计分析。

表1 诱导培养基中激素配比对‘金踯躅’茎段分化率的影响(±SE)Table 1 Effect of hormone proportion in induction medium on differentiation rate of stemsegmentof Rhododendron molle‘Jinzhizhu’ (±SE)

表1 诱导培养基中激素配比对‘金踯躅’茎段分化率的影响(±SE)Table 1 Effect of hormone proportion in induction medium on differentiation rate of stemsegmentof Rhododendron molle‘Jinzhizhu’ (±SE)

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P ＜0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P ＜0.05)difference.

编号No.激素配比Hormone proportion分化率/%1)Differentiation rate1)1 1.0 mg·L-1 2-ip-0.1 mg·L-1 NAA 83.3±5.6a 2 1.0 mg·L-1 2-ip-0.1 mg·L-1 IAA 60.0±6.7b 3 1.0 mg·L-12-ip-0.1 mg·L-1 IBA 56.7±7.1b 4 1.0 mg·L-1 6-BA-0.1 mg·L-1 NAA 36.7±7.8c 5 1.0 mg·L-16-BA-0.1 mg·L-1IAA 30.0±7.8cd 6 1.0 mg·L-1 6-BA-0.1 mg·L-1 IBA 33.3±7.0cd 7 1.0 mg·L-1KT-0.1 mg·L-1NAA16.7±5.6de 8 1.0 mg·L-1 KT-0.1 mg·L-1IAA 6.7±4.4e 9 1.0 mg·L-1KT-0.1 mg·L-1IBA3.3±3.3e

2 结果和分析

2.1 诱导培养基中激素配比对‘金踯躅’茎段分化的影响

诱导培养基中细胞分裂素和生长素浓度对‘金踯躅’茎段分化率的影响见表1。 结果显示：总体上看，在添加1.0 mg·L-12-ip 的培养基中，茎段分化率(分化率均值为66.7%)显著高于添加1.0 mg·L-16-BA 或1.0 mg·L-1KT的培养基(分化率均值分别为33.3%和8.9%)，而在添加0.1 mg·L-1NAA 的培养基中，茎段分化率(分化率均值为45.6%)显著高于添加0.1 mg·L-1IAA 或0.1 mg·L-1IBA 的培养基(分化率均值分别为32.2%和31.1%)。 其中，在添加1.0 mg·L-12-ip 和0.1 mg·L-1NAA 的培养基中，茎段基部分化出大量不定芽，分化率达到83.3%，显著高于其他培养基。

2.2 增殖培养基配比对‘金踯躅’不定芽增殖的影响

增殖培养基中2-ip、NAA 和蔗糖浓度对‘金踯躅’不定芽增殖率的影响见表2。 结果显示：在添加0.5 mg·L-12-ip、0.05 mg·L-1NAA 和20 g·L-1蔗糖，添加1.0 mg·L-12-ip、0.05 mg·L-1NAA 和30 g·L-1蔗糖以及添加1.5 mg·L-12-ip、0.10 mg·L-1NAA 和20 g·L-1蔗糖的3 组培养基中，不定芽增殖率均大于90%，且总体上显著大于其他培养基，其中后2 组培养基中不定芽增殖率均达到93.3%，增殖倍数也较大，分别为3.4 和3.5。 在添加0.5 mg·L-12-ip、0.15 mg·L-1NAA 和40 g·L-1蔗糖的培养基中，不定芽增殖率最低，仅为13.3%。

表2 增殖培养基配比对‘金踯躅’不定芽增殖率影响效应的L9(34)正交试验结果(±SE)Table 2 Result of L9(34) orthogonal experiment on effect of proportion of proliferationmediumon proliferation rate of adventitious bud of Rhododendron molle ‘Jinzhizhu’ (±SE)

表2 增殖培养基配比对‘金踯躅’不定芽增殖率影响效应的L9(34)正交试验结果(±SE)Table 2 Result of L9(34) orthogonal experiment on effect of proportion of proliferationmediumon proliferation rate of adventitious bud of Rhododendron molle ‘Jinzhizhu’ (±SE)

1)A：2-ip 浓度Concentrationof2-ip(mg·L-1)；B：NAA 浓度Concentration of NAA (mg·L-1)； C： 蔗糖浓度Concentration of sucrose (g·L-1).2)同列中不同的小写字母表示差异显著(P ＜0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P ＜0.05)difference.

编号No.因子和水平1)Factor and level1)A B C增殖率/%2)Proliferation rate 2)增殖倍数Proliferation multiple 1 0.5 0.05 20 90.0±5.1a 2.5 2 0.5 0.10 30 43.3±5.1cd 1.5 3 0.5 0.15 40 13.3±5.4d 2.0 4 1.0 0.05 30 93.3±4.4a 3.4 5 1.0 0.10 40 73.3±4.4b 1.5 6 1.0 0.15 20 86.7±5.1ab 1.7 7 1.5 0.05 40 56.7±5.1c 2.7 8 1.5 0.10 20 93.3±7.4a 3.5 9 1.5 0.15 30 56.7±5.4c 2.5

2.3 生根培养基中激素配比对‘金踯躅’试管苗生根的影响

生根培养基中生长素浓度对‘金踯躅’试管苗生根的影响见表3。 结果显示：在添加0.50 和1.00 mg·L-1NAA 的培养基中试管苗的生根率较高；其中，在添加0.50 mg·L-1NAA的生根培养基中试管苗的生根率最高，达到70.0%，显著高于其他培养基。 在添加0.50 mg·L-1NAA 和0.50 mg·L-1IBA的生根培养基中试管苗的生根率最低，仅为13.3%。 总体上看，在生根培养基中组合添加NAA 和IBA 对‘金踯躅’试管苗生根无明显的促进作用。

表3 生根培养基中激素配比对‘金踯躅’试管苗生根状况的影响(±SE)Table 3 Effect of hormone proportion in rooting medium on rooting status of Rhododendron molle ‘Jinzhizhu’ plantlet (±SE)

表3 生根培养基中激素配比对‘金踯躅’试管苗生根状况的影响(±SE)Table 3 Effect of hormone proportion in rooting medium on rooting status of Rhododendron molle ‘Jinzhizhu’ plantlet (±SE)

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P ＜0.05) Different lowercasesinthesamecolumnindicatethesignificant(P ＜0.05)difference.

编号No.激素配比Hormone proportion生根率/%1)Rooting rate1)1 0.10 mg·L-1 NAA 16.7±5.6c 2 0.50 mg·L-1NAA 70.0±6.0a 3 1.00 mg·L-1NAA 40.0±6.7b 4 0.10 mg·L-1IBA 23.3±8.7bc 5 0.50 mg·L-1IBA 33.3±7.0b 6 1.00 mg·L-1IBA 20.0±7.4c 7 0.05 mg·L-1NAA-0.05 mg·L-1IBA 13.3±5.4c 8 0.25 mg·L-1NAA-0.25 mg·L-1IBA 30.0±9.2bc 9 0.50 mg·L-1 NAA-0.50 mg·L-1 IBA 33.3±7.0bc

3 讨 论

杜鹃属(RhododendronLinn.)在中国包含9 个亚属，且各亚属种类具有不同的特性，因而，虽然对杜鹃属植物的组培已有较多研究报道[5-8]，[9]4-9，[10-13]，但杜鹃属不同种类对应的最适培养条件存在较大差别[9]36-39。 毛元荣等[6]认为，对多数杜鹃属植物而言，低盐度的培养基较为适合；本研究使用的基本培养基为WPM 培养基，属于中低盐度培养基，较适宜‘金踯躅’茎段的组培，佐证了毛元荣等[6]的研究结果。

在杜鹃属植物的组培过程中，使用不同生长调节剂可导致外植体分化率差异明显[10]；常用的细胞分裂素多为2-ip、6-BA 和KT 单独使用或组合使用[6]。 苗永美等[13]的研究结果表明：6-BA 仅有利于某些杜鹃属种类的组培，而2-ip 则有利于多数杜鹃属种类的组培，且某些种类的丛生芽需转移至含2-ip 的培养基上才能生长良好。 本研究中，在添加2-ip 的培养基上‘金踯躅’茎段分化率显著高于添加6-BA 或KT 的培养基，并以2-ip 和NAA 组合使用的促分化效果最好，说明在诱导培养基中添加2-ip 有利于‘金踯躅’茎段的分化。

羊踯躅扦插生根困难，生根率最高只能达到43.2%[3]34。通常情况下在生根培养基中添加NAA、IBA 和IAA 可促进试管苗生根，但单一生长素及生长素组合对生根的作用效应存在差异，其中组合使用生长素对某些植物试管苗的生根有协同促进作用[14]。 在本研究中，仅添加NAA 可使‘金踯躅’试管苗的生根率显著提高，但NAA 过高则导致其生根率降低，这可能与‘金踯躅’内在特性或内源激素水平有关[11]，因此，在‘金踯躅’试管苗的生根培养过程中应将生长素浓度控制在适宜范围内。