多功能纳米基因载体的制备与分析

刘诗音

摘要：本文通过反向微乳聚合等化学方法，成功制备出一种集磁性、荧光于一体的SiO2纳米粒子，并以多聚赖氨酸（PLL）对其表面进行修饰，修饰后的纳米粒子能够有效地与DNA结合和分离，并保护DNA免受DNaseI的降解。该纳米基因载体能够介导外源DNA转化至植物细胞当中，为纳米基因载体在转基因植物的研究中及应用打下了基础。

关键词：纳米粒子;基因载体;转基因植物

中图分类号：R944.9                                     文献标识码：  A                      DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.12.022

纳米技术指制造出0.1～100nm量度的物质材料，直接操纵原子、分子、原子團或分子团，探究原子或分子的运动特性和规律[1-3]。生物纳米技术是生物技术和纳米技术的融合技术，是有关生命科学和纳米技术的新方法、新技术[4-6]。纳米技术在生物技术中的应用目前主要包括以下方面：基因载体[7-11];纳米尺度上的单细胞活体实时检测[12-17];药物的靶向和定向释放细胞[18-24]、DNA的分离等[25-27]。

本文拟构建一种新型的多功能纳米基因载体，即集荧光、磁性于一体的二氧化硅纳米基因载体。将荧光量子点和磁性纳米微粒同时集成到尺寸可控的硅纳米粒子中，并在纳米粒子表面修饰多聚赖氨酸（Polylysine，PLL）。荧光量子点被包埋在纳米载体内部，便于实时、稳定、高效检测。引入磁性功能，可在外磁场的作用下，提高外源基因进入细胞的效率，这将为纳米基因载体在植物转基因中的研究与应用提供崭新的途径。

1 实验方法

1.1荧光磁性SiO2纳米粒子（Fluorescence-magnetismsilicananopaticles，FMSNPs）的制备

取100ml三口瓶，加入25ml环己烷，4ml正己醇，5ml TritonX-100，0.25ml正硅酸乙酯，0.25ml Fe3O4，剧烈搅拌30min后形成反胶束。水浴加热25℃，机械搅拌，加入CdTe溶液0.25ml，氨水0.075ml，避光反应24h。反应结束后，取反应液体滴加丙酮破乳，静止沉淀，有乳白色微粒生成。8000rpm，10min，弃上清，收集沉淀。沉淀用乙醇洗涤3次，100℃真空干燥，室温贮存备用。通过扫描电镜检测荧光磁性SiO2纳米粒子的尺寸分布。

1.2 荧光磁性SiO2纳米粒子的表面修饰

PBS磷酸缓冲液的配制，按比例称取磷酸氢二钠与磷酸二氢钠，配制成pH=7.4的0.2mol/ml溶液，取2.5ml，稀释20倍至50ml。

取1mg荧光磁性SiO2粒子（FMSNPs）溶于1ml PBS，再加入0.05ml（1mg/ml）多聚赖氨酸（PLL），室温震荡1h，用Zata电位仪检测纳米粒子是否成功被PLL修饰。

1.3修饰PLL的荧光磁性SiO2纳米粒子与DNA的结合

纳米粒子与质粒DNA按照50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，

2∶1，1∶1的比例将PLL-NPS与质粒DNA混合，同样将无纳米粒子的PBS与DNA按照上述比例充分混合均匀，室温放置0.5h，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 PLL修饰的荧光磁性SiO2纳米粒子与DNA的分离

配制0.9%NaCl pH值为7.4 PBS溶液，按1∶1的比例（各5ul）与NPS-PLL-DNA结合物混合，37℃放置2h。

1.5 荧光磁性SiO2纳米粒子对DNA的保护作用

将DNAaseI按1U∶10ul的比例加入NPS-PLL-DNA结合物溶液中，37℃放置2h。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PLL修饰的荧光磁性SiO2纳米粒子与DNA的结合和分离。

2 结果与分析

2.1荧光磁性SiO2粒子的尺寸

电镜分析：荧光磁性SiO2的粒子电镜图见图1，尺寸：50～80nm。

性状：白色粉末，溶液成乳白色，340nm紫外灯照射下成粉红色。

2.2 荧光磁性SiO2纳米粒子的表面修饰的结果与分析

zeta电位仪检测，未经修饰的荧光磁性SiO2纳米粒子的电位值-3.6mV，经PLL修饰后的荧光磁性SiO2纳米粒子的电位值为12.4mV，说明PLL已经成功地修饰到荧光磁性SiO2纳米粒子表面上，并具有较强的正电性。

2.3修饰PLL的荧光磁性SiO2纳米粒子与DNA结合分析

FMSNPs与质粒DNA按50∶1，30∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1的比例进行混合，FMSNPs与质粒DNA结合状况见图2，1～4号孔道代表空白对照，即不含FMSNPs，5～8号FMSNPs与质粒DNA混合的样本。从电泳图上可以清晰地看到FMSNPs与质粒DNA混合的样本均没有DNA条带。当质粒DNA结合到NPS-PLL上时，在电泳过程中，因为NPS-PLL粒径很大，无法在胶板上移动，被滞留在胶空内，说明质粒DNA已经结合到NPS-PLL上。

2.4 修饰PLL的荧光磁性SiO2纳米粒子与DNA的分离分析

PLL修饰的荧光磁性SiO2纳米粒子与DNA的分离：0.9%NaCl pH=7.4  PBS溶液可将NPS-PLL-DNA结合物上的质粒DNA洗脱下来，从照片可以看出，第7～11的试样在260nm紫外光出现DNA条带，说明质粒DNA已经从NPS-PLL-DNA结合物上洗脱下来，如图3。

2.5修饰PLL的荧光磁性SiO2纳米粒子对DNA的保护实验的结果与分析

修饰PLL的荧光磁性SiO2纳米粒子对DNA的保护：DNaseI可将质粒DNA酶切，切除下來的DNA可在胶板上泳动并在260nm紫外光出现DNA条带。从照片上可以看到2～6孔的试样并没有出现DNA条带，说明质粒DNA没有被DNAaseI酶切，所以说NPS-PLL对DNA有保护作用。

3 结语

本文通过微乳聚合等化学方法成功制备了一种集荧光、磁性于一体的PLL SiO2纳米粒子，并以PLL对其进行表面修饰，修饰后的纳米粒子能够成功地与DNA结合和分离，并保护DNA免受DNaseI的降解作用，同时，该纳米基因载体能够介导外源DNA转化植物细胞中，这为纳米基因载体在植物转基因中的进一步应用打下了基础。

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