时间治疗学在大鼠坐骨神经挤压伤电磁场治疗中的应用

康 乐，韩 怡，朱 澍，王晓东，陈 臣，吴 宁，张 琦，革 军

周围神经损伤是骨科常见疾病之一，主要继发于外伤、不当用力及手术等各类外力的直接及间接作用，愈合缓慢，预后效果不确定，治疗颇为棘手。近年来人们尝试采用电刺激、神经营养因子介入、神经生物支架等新方法，取得了一定成效[1-3]。本课题组前期将时间治疗学的概念引入坐骨神经长节段缺损大鼠的神经支架复合电磁场治疗中，效果良好[4]。但在实验中存在神经支架材料和时间治疗学两种正性干预因素，且神经支架本身对于个体间神经修复存在诸多不确定性，因此时间治疗学的单一作用究竟如何，还不得而知。本实验去除神经支架这一干预因素，仅探讨时间治疗学在大鼠坐骨神经挤压伤电磁场治疗中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料

36只成年SD雌性大鼠购自空军军医大学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK[军] 2012-0007，体重240～250 g，符合动物伦理委员会规定。戊二醛、戊巴比妥、四氧化锇、甲苯胺蓝购自美国Sigma公司，电磁场装置为自制[4]。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组 采用随机成组设计，将大鼠按随机数字表法分为日间治疗组、夜间治疗组和空白对照组（仅建立模型不进行电磁场治疗），每组12只，分笼饲养。

1.2.2 坐骨神经挤压伤模型建立 采用1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，侧卧位切开大鼠左下肢外侧皮肤，钝性分离筋膜和肌肉，暴露左侧坐骨神经。剥除神经纤维膜，充分松解神经，在梨状肌下缘约0.5 cm处以有齿镊全齿夹坐骨神经，夹闭3次，10 s/次，挤压宽度约为5 mm。于夹痕上5 mm处神经外膜进行缝线标记。消毒并缝合伤口，常规饲养，1周后进行后续试验。

1.2.3 电磁场治疗 将日间治疗组大鼠于上午9：00—11：00置于自制电磁场发生装置中治疗。电磁场相关参数：脉冲宽度0.2 ms、间隔0.05 ms，脉冲上升及下降时间分别为0.3 μs和2.0 μs，磁场强度9.6 Gs。将夜间治疗组大鼠于21：00—23：00置于相同电磁场环境中。治疗组动物每天治疗1次，每次2 h，连续治疗，治疗时使用自然光线（即光源均来自采光窗，不使用人工光源），现场环境保持安静干燥；空白对照组正常饲养，不予电磁场治疗。

1.3 检测指标

1.3.1 坐骨神经功能指数（sciatic functional index，SFI）测量 治疗后8、12周时各组随机选取6只大鼠检测并记录其SFI。具体方法为：实验前训练每只大鼠从收集通道的一端走向另外一端，行走过程保证大鼠顺利通过。训练完成后，在通道下方铺设长100 cm、宽10 cm的记录纸，于术足部位涂抹红色染料，令大鼠再次通过通道，通道底部的记录纸则印有大鼠足迹。将这些完整的足印扫描后测量以下各值：第3足趾尖到足跟的距离PL，第1、5趾间距离TS，第2、4趾间距离IT。利用以下公式计算：SFI=(-38.3×[EPL+NPL] /NPL)+(109.5×[ETS×NTS] /NTS)+(13.3×[EIT×NIT] /NIT)×8.8[2,4]，其中E前缀代表术侧、N前缀代表非术侧。数值越接近于0，说明其运动功能恢复越好；数值越接近于-100，其运动功能丧失程度越高。

1.3.2 坐骨神经透射电镜检查 各组大鼠于治疗8、12周时分别随机选取6只进行标本采集。按照神经缝线标记处前后2.5 mm取坐骨神经标本段（约5 mm），戊二醛固定24 h后继续以1%四氧化锇固定2 h。修剪神经成块后选择夹闭部位进行树脂包埋，制作坐骨神经横切面超薄切片，根据神经透射电镜图像计算神经元（有髓神经）数量、再生神经面积，记录有髓神经直径。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

如表1所示，电磁场治疗8、12周，日间治疗组SFI均显著优于夜间治疗组及空白对照组。日间治疗组大鼠神经元数量、再生神经面积、有髓神经直径均明显大于夜间治疗组，而空白对照组各指标均明显小于治疗组（P＜0.05），透射电镜图片见图1。

3 讨论

3.1 周围神经损伤的治疗现状

对于较为严重的周围神经损伤，目前临床上没有特别有效的治疗方法，通常以自体神经移植作为神经修复手术的“金标准”，但存在神经供体有限、移植术后供区感觉异常等问题。近年来随着神经损伤修复新技术的不断涌现，电磁场治疗受到高度关注[5]。目前该方法主要用于骨折、骨关节炎、股骨头坏死等的辅助治疗[6-9]，对于神经损伤亦有很好的治疗效果，安全无创，操作简便。其作用机制可能与刺激雪旺氏细胞增殖，利于无髓轴索再生，进而促进周围神经再生有关[10]。

3.2 时间治疗学的作用机制及应用

在现代医学中，时间治疗学主要用于心血管疾病、皮肤病等疾病的治疗，效果满意[11-13]，而在中枢及周围神经损伤领域，时间治疗学方法目前主要用于减轻中枢系统病变产生的精神症状[14-15]。

众所周知，随着瓦勒氏变性进程的推进，周围神经损伤后其自身的免疫环境将发生改变，进而对局部炎性因子及神经营养因子的分泌造成影响[16]。当昼夜节律变化时，机体内微环境可能发生相应改变，损伤神经的局部神经因子水平、血管化程度随之发生变化，并对神经再生进程产生影响。因此，遵从时间治疗学规律并按照合理的时间治疗学方案施治，有望促进机体健康，提高常规治疗的效果。

表1 各组大鼠治疗后各时间点SFI及透射电镜结果比较（±s，n=6）

表1 各组大鼠治疗后各时间点SFI及透射电镜结果比较（±s，n=6）

注：SFI：坐骨神经功能指数

日间治疗组夜间治疗组空白对照组F值P值SFI 8周-60.3±4.8-75.3±7.3-82.1±5.2 12.642 0.001 12周-42.7±5.8-55.2±3.2-61.6±2.2 13.816 0.001神经元数量/×103 8周7.67±0.36 5.41±0.67 3.17±0.51 150.000 0.000 12周10.43±0.29 8.14±0.13 4.12±0.33 1 338.301 0.000再生神经面积/mm2 8周0.89±0.11 0.73±0.03 0.52±0.12 31.216 0.000 12周1.30±0.37 0.91±0.18 0.71±0.08 32.810 0.000有髓神经直径/μm 8周3.17±0.13 3.02±0.24 2.71±0.27 24.039 0.000 12周6.77±0.45 5.14±0.61 4.17±0.51 60.355 0.000

前期研究中我们将时间治疗学用于大鼠长节段坐骨神经缺损的电磁场治疗中，结果表明，按大鼠生物学时间节律制定治疗方案，可以明显提高神经再生效率，促进神经对靶器官的再支配[4]。分析其作用机制，可能是由于电磁场与生物节律共同影响机体的神经和体液调节，尤其是促进各类神经生长因子的分泌，从而加速了神经再生进程。本实验中我们也看到，日间治疗组的治疗效果要明显优于夜间治疗组，有力证实了时间治疗学在电磁场坐骨神经修复中的应用价值。

图1 各组坐骨神经透射电镜扫描图片（2 000×，Bar=10 μm）1A～1C 治疗8周 1D～1F治疗12周

3.3 治疗时间点的选择

21:00—23 :00大鼠开始进入夜间活动的兴奋期，其生理状态与人类晨起白天时的状态较为相似，各类激素分泌达到峰值。参考相关大鼠生物节律的文献[17]，同时考虑目前临床大多数手术和康复治疗的时间（9:00—11:00），我们选择21:00—23:00以及12 h后的9:00—11:00两个时间段作为治疗效应的观察时间点。结果表明，大鼠在日间休息时坐骨神经修复效果更好，提示人类的神经修复可能需要在夜间完成。

然而，夜间治疗产生的噪声等负面因素是否大于时间治疗学效应，目前不得而知；对于坐骨神经修复效果，仅通过神经电镜表现进行评估尚嫌不足；时间治疗学手段是否有助于提高神经再支配的准确性也有待进一步观察；比较时间治疗学效应下促进大鼠坐骨神经修复的主导因素（神经营养因子种类、大鼠本身生理习性、血管化等）与人类神经修复的异同，也将是我们下一步工作的重点。