表面增强拉曼光谱技术检测食品及农产品中的非法添加剂

段贵娇，张健伟，张志彬，骆延平

(广东环凯微生物科技有限公司，广东 广州，510663)

食品添加剂是为改善食品品质和色、香、味,以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品中的物质。我国基于相应原则制定了关于食品添加剂的使用标准，规定食品添加剂的最大使用量及其最大残留量[1]。尽管国家有相关规定，但滥用食品添加剂仍时有发生，引发人们对于食品安全的担忧。

传统检测食品添加剂的方法包括高效液相色谱(HPLC)[2]、液质联用(LC-MS)[3]、气相色谱(GC)[4]及气质联用(GC-MS)[5]等。这些方法灵敏度高、重复性好，但操作复杂、检测时间长、易损伤样品。随着社会的发展，人们越来越渴望能方便、快速对食品添加剂进行检测，近年来迅猛发展的表面增强拉曼光谱技术恰好满足了这一需求。

20世纪初，印度科学家C.V.拉曼(Raman)发现了拉曼散射效应，可根据其进行物质的分析，但拉曼散射效应极其微弱，难以准确捕捉到拉曼信号，因此限制了拉曼光谱的发展。经过半个世纪的发展，1974年, FLEISCHMAN等[6]发现吸附在粗糙银电极表面上的单分子层吡啶具有异常增强的拉曼信号。之后随着技术的不断发展，研究者们发现在纳米贵金属表面或者颗粒体系能够使得拉曼信号得到显著的增强，即表面增强拉曼效应(surface enhanced raman scattering, SERS)，进而大力促进了拉曼光谱在化学分析中的应用。由于其可提供目标分子的指纹图谱(高特异性)，具有操作简单、仪器易便携化、用量少、不损坏样品、灵敏度高等特点，在医疗卫生、食品安全(如图1)、案件侦查等领域有着非常广阔的应用前景。本文主要讲述了表面增强拉曼光谱技术在检测食品非法添加剂方面的应用，综合了几年来热点新闻报道的食品安全问题，将各种非法添加剂按照其化学及药理性质进行分类，主要从猪肉、牛羊肉及肝脏中的β-受体激动剂，猪肉、禽肉和动物性水产品中的硝基呋喃类药物，水产品中孔雀石绿，肉类产品中镇定剂，乳制品中的三聚氰胺这五个方面进行阐述。

图1 表面增强拉曼光谱在食品添加剂检测中的应用Fig.1 The application for SERS in the detection of food additives

1 猪肉、牛羊肉及肝脏中的β-受体激动剂

β-受体激动剂一般都具有舒张气管平滑肌的作用，在医学上用来治疗哮喘等气管性疾病，当此类药物用于畜牧业时，有明显的促进生长、提高瘦肉率及减少脂肪的作用，因此这类药物常被当做瘦肉精来使用。由于其适用范围及安全性，目前国际上各国颁布的限制法令不尽相同，而我国已明确限制其在畜牧业中使用，本文主要详述了盐酸克仑特罗、苯乙醇胺A及莱克多巴胺3种非法添加剂的检测。图1是几种常见β-受体激动剂的分子结构，由图1可以看出，它们都均有苯环等具有较强拉曼信号的官能团，因此可以利用SERS来对其进行高特异性和高灵敏度的检测。

图2 几种β-受体激动剂的分子结构Fig.2 The molecular structure of several β-receptor agonists

1.1 盐酸克仑特罗

盐酸克仑特罗俗称瘦肉精，添加在饲料或饮用水中可明显提升瘦肉率，而人食用这种肉后可能导致中毒。我国自2002年9月10日起禁止在饲料及动物饮用水中使用该添加剂。李明心等[7]创建了以胶体Au纳米颗粒和Au@Ag核壳纳米颗粒为基础的表面增强拉曼光谱免疫层析分析法(SERS-ICA)，并将其用于对盐酸克伦特罗的高灵敏度检测；其中盐酸克伦特罗检测的灵敏度为0.01 ng/mL，检出限为6×10-5ng/mL。甘盛等[8]以纳米银(AgNPs)溶胶为SERS基底检测盐酸克伦特罗等β-受体激动剂于给药和停药期间在猪尿液、毛发和组织中等的浓度；其中盐酸克伦特罗等几种瘦肉精在标准溶液中的检出限0.05 μg/L，尿液、血液中为1 μg/mL， 粪便、毛发以及肌肉等组织为1 μg/kg；该检测方法便捷灵敏，适用于研究β-受体激动剂在生猪体内的代谢。XIE等[9]以Au-MBA@Ag-Ab为探针，预处理时溶液中游离的盐酸克仑特罗与预先涂布在ICA条带上的盐酸克仑特罗竞争性地与抗原结合，随后通过检测测试线上SERS强度来检测盐酸克仑特罗含量；该实验检测盐酸克仑特罗的IC50和检测限(LOD)值分别为0.02 ng/mL和0.24 pg/mL，且实验一般在15 min内就可以完成，可以达到快速、灵敏的检测效果。

1.2 苯乙醇胺A

苯乙醇胺A(PA)亦可被称之为瘦肉精，在我国同样禁止添加于动物饲料及饮用水中。LI等[10]以Au-MBA@Ag-Ab 为探针，与苯乙醇胺A特异性结合后，通过SERS检测到PA。这种新型的免疫层析法(ICA)的IC50及LOD值分别为0.06 ng/mL和0.32 pg/mL，能快速、准确地检测尿液样品中的PA，也可用于其他食品添加剂的检测。

1.3 莱克多巴胺

莱克多巴胺作为一种新型人工合成的β-受体激动剂，作用与盐酸克仑特罗、苯乙醇胺A类似，也属于瘦肉精的一种，我国自2011年12月5日起禁止生产、销售该物质。窦斌[11]以55 nm的纳米金(AuNPs)溶胶作为SERS活性基底，检测猪毛提取液中的莱克多巴胺；在碱性条件下,沙丁胺醇的检测限达到50 ng/mL。翟福丽等[12]以AuNPs为SERS基底，检测猪尿样中的莱克多巴胺，得出标准溶液的最低检测浓度为0.1 mg/mL， 分析时间小于30 min，基本满足迅速、灵敏地检测莱克多巴胺。YU等[13]以AuNPs为SERS活性基底，将其与盐酸克伦特罗及莱克多巴胺两种物质的抗体结合，进而检测到游离的盐酸克伦特罗和莱克多巴胺；在该实验中两种检测物竞争性地与纳米探针结合，实现了多重抗体的SERS检测；该方法的检测限(LOD)为1.0 pg/mL，在食品添加剂检测方面具有很大的应用潜力。

表1 SERS检测3种β受体激动剂类药物分子的比较Table 1 Comparison of three β-receptor agonist drugs

2 猪肉、禽肉和动物性水产品中的硝基呋喃类药物

硝基呋喃类药物作为广谱抗生素，对大多数细菌、真菌及病原体有强烈的杀灭作用。但该类药物及其代谢产物对人体有致癌和致畸胎的副作用，因此我国于2010年将呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃西林4种硝基呋喃类药物列为违法添加剂。XIE等[14]以50 nm的AuNPs为SERS活性基底，通过特征性SERS峰对呋喃丹宁和呋喃他酮进行SERS定性分析；在1 420 cm-1和1 456 cm-1处的峰可以用来区分混合物中的两种化合物；在最佳条件下，检测限可达5 ppm。竺芯宇等[15]分别用Au溶胶和Fe3O4@Ag(Ag壳厚度为40 nm左右)为基底检测4种硝基呋喃类药物(N1呋喃唑酮，N2呋喃妥因，N3呋喃西林，N4呋喃他酮)；以Au溶胶为基底时N1、N2、N4的检测限最低可至5 ppm，由于N3的结构特殊性无法与Au结合，导致无法检测出；以Fe3O4@Ag为基底时四种物质检测限最低可达0.1 ppm。呋喃他酮一般难以直接检测，但是其代谢产物5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)能通过SERS进行检测，LI等[16]制备了针对AMOZ和4-巯基苯甲酸(MBA)双重标记的胶体GNP(如Ab-Au-MBA)的单克隆抗体(mAb)用作免疫探针，能快速测定AMOZ；该法的IC50值和检测限(LOD)分别为0.04 ng/mL和0.28 pg/mL，该免疫探针与其他3种硝基呋喃类药物没有交叉反应性。利用SERS对猪肉、禽肉和动物性水产品中硝基呋喃类药物进行检测，可以实现快速、准确的检测，并且灵敏度高、特异性强，故可广泛应用于食品添加剂的检测。

3 水产品中孔雀石绿

孔雀石绿是人工合成的有机化学物质，对细菌、真菌以及病原体等有一定的杀灭作用，可用于水产养殖[17]。但孔雀石绿长期超量的使用会对人体有致癌作用，故此我国明令禁止添加[18]。余婉松[19]以55 nm金溶胶为SERS活性基底，对7种不同鱼肉(罗非鱼，鲳鱼、乌鳢、草鱼、鲫鱼、鱼、花鲢)中孔雀石绿及其代谢物进行检测，灵敏度在2～10 ng/g，相比传统的色谱法，具有快速，无需特殊样品前处理等复杂步骤。顾振华等[20]利用孔雀石绿的拉曼光谱特征峰(432～437 cm-1、1 166～1 170 cm-1、1 613～1 617 cm-1)及其强度,快速对孔雀石绿进行定性定量检测，检测限为5.0 μg/L，相比传统的方法，具有特异性强，抗干扰能力好等优点。SUN等[21]设计制备具有PMMA/Ag/石墨烯/Ag/石墨烯杂化结构的高柔韧性且高灵敏度的SERS薄膜，可直接与待测样品进行吸附；试验中以其为SERS基底，检测鱼表皮的孔雀石绿的含量，5 min内完成检测，且灵敏度高达10-7mol/L，非常适用于食品添加剂的检测，由于石墨烯的引入，稳定了贵金属纳米银的性质，得到了更加稳定的拉曼增强信号，在保证灵敏度的同时，大大增强了检测的重现性。

4 肉类产品中镇定剂

镇定剂具有抗焦虑、镇定、改善抑郁症及改善睡眠质量的功效，吩噻嗪类药物作为其中一种，在我国动物源性食品中禁止检出，但因其能有效降低动物运输过程中的死亡率且间接起到增肥作用，仍有不法商人使用，因此高效监测肉类食品中镇定剂变得愈加迫切。

目前，国内外已有吩噻嗪类药物及其代谢物的相关报道。如魏晋梅等[22]应用高分辨率液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定牛肉中包括氯丙嗪、乙酰丙嗪及甲苯噻嗪在内的24种镇静剂类兽药残留量，各药物的LODs在0.2～2.5 μg/kg，定量限(LOQ)在0.5～5 μg/kg。孙雷等[23]利用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测猪肉和猪肾中残留的10种镇静剂类药物，检出限为0.5 μg/kg。FLEISCHMANN等[6]应用液相色谱-质谱联用(GC-MS)检测猪组织中4种镇定剂含量，检出限在0.5～10 μg/kg。齐士林等[24]利用超高效液相色谱-电喷雾电离质谱(UPLC-ESIMS/MS)对动物源食品中氯丙嗪、异丙嗪及其代谢物做了测定，检出限在0.3～1.5 μg/kg。此外，吴宁鹏等[25]利用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法(UPLC-QTOF)筛查饲料中11种镇静剂类药物，饲料基质中检出限为0.1 mg/kg。尽管有检测方法众多，但灵敏度普遍不高，难以满足肉类食品中添加剂的检测需求。

而SERS技术灵敏度高、检测快速且简便，将SERS技术应用到肉类食品中镇定剂的检测将会极大地提升检测的灵敏度和准确性。目前，SERS技术用于肉类中镇定剂的检测报道很少，说明SERS在这方面的研究具有较大的潜力。

5 乳制品中的三聚氰胺

三聚氰胺，俗名蛋白精，因对人体有害，被限制用作食品添加剂。由于食品工业中蛋白质含量的检测存在一定缺陷，因此被不法商人用作提升蛋白质含量的指标，给人们的身心带来极大的创伤[26-28]。三聚氰胺由于含有三嗪类含氮杂环结构，SERS信号比较强，可直接进行SERS检测。杨欣等[29]为比较牛奶中三聚氰胺表面增强拉曼光谱法与国标法(GB/T 22388—2008/第二法液相色谱-质谱/质谱法)的差异，分别用表面增强拉曼光谱检测法和国标法检测牛奶中的三聚氰胺，结果表明，两种方法在阳性样品的判定上结论一致；其中表面增强拉曼光谱法的平均回收率和精密度分别为117.3%和13.2%，在709 nm左右处出现三聚氰胺特征峰；该方法操作简单、方便快捷，可用于收购原奶及市场监督等环节的检测。杨青青[30]以银纳米粒子胶体为SERS増强基底来检测溶液中的三聚氰胺，以高浓度NaCl为聚沉剂，用NaOH将待测液pH调至碱性，实验中三聚氯胺的线性检测量为0.01～4.80 mg/L，相关系数为0.998， 回收率为94.4%～102.8%，该方法适用于牛奶及奶粉中三聚氰胺的快速测定。GIOVANNOZZI等[31]以金纳米颗粒为SERS活性基底，定量检测液体奶中三聚氰胺的含量，检测限为0.17 mg/L，实验提取程序较少，能有效用于检测牛奶中的三聚氰胺。

6 展望

表面增强拉曼光谱技术虽起步较晚，但因其快速、操作简单、灵敏度高、无损、可定性定量分析等优点迅速应用于诸多领域。尽管如此，表面增强拉曼色谱仍存在一些问题亟待解决。

就表面增强拉曼色谱发展历程来看，从发现拉曼散射到应用SERS技术经历了半个多世纪，直至21世纪才真正得以广泛应用。究其原因，无外乎两点：仪器设备不够先进、SERS理论研究较落后。第一点现如今的科学技术已能应用SERS技术进行分析检测，但发展空间还很大，比如向更便携、低成本的方向努力。针对第二点，目前科学界提出几种主要的观点：基于分子金属成键作用和光诱导电荷转移作用的化学增强机制以及基于表面镜像场、表面等离子体共振和避雷针效应的电磁场物理增强机制，而这两种观点还只是理论模型，科学界尚未达成共识，有待后人继续努力。而将SERS技术应用于分析领域，关键是制备结构均匀、性质稳定、增强能力强的基底。传统的拉曼光谱虽然具有很好的定性能力，但是样品分子的拉曼信号一般都很弱，远远不能满足样品分子的痕量检测。贵金属纳米粒如金、银等周围存在电磁场，当样品分子靠近这个电磁场的时候，拉曼信号被很大程度地增大，从而使极微量的样品分子也能被检测得到，这种现象就是表面增强拉曼现象。但是，由于贵金属纳米粒子周围磁场分布是不均匀的，在一定程度上，距离纳米粒子越近的地方，磁场越强，增强效果越好，而处于溶液状态的样品分子距离纳米粒子的距离有大有小，造成了信号增强能力的差异，此外，纳米粒子不同的团聚程度，也会导致磁场分布不均，使检测到的拉曼信号不稳定。基于以上问题，如果我们将贵金属纳米粒子制备成均匀性好、稳定性强的SERS基底，所检测到的拉曼信号将大大增强，同样地，所制备的拉曼基底如果具有很好的局域表面等离子共振效应，具有很强的电磁场，那么得到的检测灵敏度也将大大提高。而在检测食品添加剂时，由于SERS基底仅能捕捉到部分基团(含有N、S等杂原子，硝基、氨基、羧基等基团以及多芳环或杂环的大共轭体系)的信号，而对其他许多基团没有响应，此时可能利用标记拉曼信号分子的方法来进行样品的检测[32-35]。

因此在将来，我们不仅需要克服以上缺点，还应加大SERS理论研究，研发更加方便、快捷和稳定的便携式仪器。如果解决了以上缺点，拉曼由于具有特殊的指纹图谱(定性好)、原位、无损、快速、灵敏等优点，将很好地解决目前检测手段中存在的问题，甚至是替代传统的技术成为食品安全检测中的强有力和主流的技术手段，如(1)利用便携式拉曼光谱进行食品安全的现场快速筛查；(2)通过光纤的灵活性和传导性，进行食品样品的远程检测；(3)进行非法食品添加剂种类的快速鉴别；(4)进行食品安全的基础研究，如利用拉曼的原位检测和物质结构发生改变后产生相应的拉曼指纹图谱的变化，进行非法食品添加剂对人体产生危害的毒性机理的研究和证明；(5)进行非法食品添加剂添加到食物后产生作用的机理，或者是非法添加剂添加到食品后产生有毒物质的机理等进行研究；(6)同时也可将SERS技术与其他技术联用，如将SERS与色谱技术进行结合，即可发挥SERS定性能力强，灵敏度高的优点，又可结合色谱的强大分离能力；再如将SERS技术与微流控芯片技术进行结合，可实现检测的高灵敏、高特异性、高通量、微型化检测，这将使SERS技术在食品添加剂分析检测领域发挥着越来越大的作用。