辣椒籽抗菌肽的安全性评价及其在玉米防霉中的应用

韩玉竹，赵建军，陈强，吴长凤，熊伟亮，杨叶梅,2*

1(西南大学 动物科学学院，重庆，402460)2(重庆市畜牧科学院，重庆，402460)

辣椒是全世界范围内的一种普遍使用的调味品。其副产物辣椒籽占其干果含量的30%～60%，目前我国关于辣椒籽的利用仅集中在辣椒籽油脂研究和抗氧化等方面[1]。有研究报道辣椒籽的主要营养成分包含膳食纤维、脂肪和蛋白质，且其包含9种必须氨基酸，说明其具备较高的开发利用价值[2]。截至目前为止，虽无关于辣椒籽蛋白中存在有毒蛋白的报道，但是关于从中提取的抗菌肽是否含毒以及累计食用后会不会影响食用者的健康问题尚无相关报道。

玉米是世界三大粮食作物之一，其产量仅次于小麦和大米。据有关报道预测到2025年发展中国家对玉米的需求将增加1倍，玉米也将成为全球范围内产量最大的作物[3]。在我国玉米产量已超过2.16亿t，占粮食总产量比重也提升到了35.53%[4]。但玉米和其他粮食作物一样在储存期间容易受到霉菌污染。有研究表明，玉米储存期间如果管理不当造成霉菌繁殖，将会造成50%～80%的损失[5]。

本研究前期发现辣椒籽抗菌肽对玉米、小麦、饲料贮藏过程中的优势腐败真菌(曲霉属、青霉属、镰刀菌属)具有较强的抑制活性，经纯化检测发现，主要是分子质量在7.8 kDa左右的抗菌肽(PSP 7.8)起作用。因此，本试验根据《食品安全性毒理学评价程序和方法》对辣椒籽抗菌肽的安全性进行评价。同时，以目前市场上防霉应用效果较好的那他霉素和丙酸钙为对照，依据《玉米储存品质判定标准》，从霉菌总数和脂肪酸值2个方面对辣椒籽抗菌肽在玉米贮藏中的应用效果进行研究，为辣椒籽抗菌肽作为添加剂在食品、饲料等行业中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

辣椒籽抗菌肽的制备：辣椒籽的提取方法采用试验室前期优化后的步骤。具体为，辣椒所选品种为贵州灯笼椒，其辣椒籽粉碎后，用无水乙醚浸提过夜，去除粗脂肪。按料液比1∶5.05添加至EDTA缓冲液(10 mmol/L Na2HPO4，15 mmol/L NaH2PO4，100 mmol/L KCl, 1.5% EDTA，pH 5.4)中，4 ℃条件下16.13h。将浸出溶液用8层纱布过滤， 8 000 r/min离心15 min，取上清液按计量81.15%饱和度所需的固体硫酸铵量，研磨粉碎后缓慢加入，均匀搅拌至充分溶解，4 ℃静止4 h，10 000 r/min离心15 min，沉淀冷冻干燥为辣椒籽抗菌肽粗品。进一步结合透析袋脱盐、10 kDa超滤管超滤以及葡聚糖凝胶层析对辣椒籽抗菌肽进行分离纯化，收集经Tricine-SDS-PAGE检测分子质量在7.8 kDa左右的目标抗菌肽(PSP 7.8)冷冻干燥备用。

试验动物：健康的昆明种小白鼠、SD大鼠、基础饲料及笼底垫料均由西南大学动物科学学院试验动物中心提供。

血清生化指标试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；那他霉素(纯度95%),浙江新银象生物工程有限公司；丙酸钙(纯度99%)，南通奥凯生物技术开发有限公司；玉米，购于重庆市荣昌区农贸市场。

1.2 小鼠急性毒性试验

将60只健康昆明种小白鼠随机分成6组，每组10只(雌雄各半)，预饲3 d后进行正式试验。灌胃前禁食12 h，按照抗菌肽的浓度分为6个组(1组对照组灌喂等量生理盐水，2～6组分别按照每kg体重灌喂辣椒籽抗菌肽0.008、0.04、0.2、1、5 g)。灌喂后每天定时饲喂并观察所有组小鼠的精神状态和死亡状况。连续观察7 d，并记录小鼠中毒情况、异常反应和死亡数量。试验结束后解剖，肉眼观察各种脏器及组织的病理变化，并测定其肝脏、脾脏和肾脏的脏器指数。脏器指数测定按公式(1)进行计算：

(1)

1.3 亚慢性毒性试验

将40只健康SD大鼠随机分成2组，每组20只(雌雄各半)，预饲3 d后进行正式试验。其中一组按照300 mg/kg体重每天定时灌喂无菌生理盐水溶解的抗菌肽溶液，另一组作对照组，每天同时灌喂等体积无菌生理盐水，每天定时饲喂并观察大鼠精神状态等。试验持续30 d。

大鼠每天的精神状态和病理组织检查、脏器指数、增重和饲料利用率的观察及测定计算方法均同急性毒性试验1.2。试验结束后进行眼静脉采血，采用TEK-Ⅱ全自动血细胞分析仪测定试验大鼠的血常规指标，大鼠的血清生化指标按相应的试剂盒说明书步骤进行测定。

1.4 辣椒籽抗菌肽在玉米贮藏中的应用

本试验设置了6个处理组，每个处理6个平行，每份贮藏玉米1 000 g。那他霉素和丙酸钙的添加量按添加剂手册建议添加量添加，辣椒籽抗菌肽添加量根据前期黄曲霉抑菌试验的最低抑菌浓度添加。具体添加处理为：对照(无添加)，处理1(辣椒籽抗菌肽 0.075 g/kg)，处理2(辣椒籽抗菌肽 0.15 g/kg)，处理3(辣椒籽抗菌肽 0.3 g /kg)，处理4(丙酸钙2.26 g/kg)， 处理5(那他霉素0.3 g/kg)。玉米初始水分含量调节至15%左右，4 ℃放置24 h，待玉米吸收水分后放置于温度为28 ℃、湿度为75%的培养箱中贮藏，20 d后进行霉菌总数和脂肪酸含量的检测。

霉菌总数的测定参照国标GB/T 13092—2006进行[6]。以无菌操作准确称取样品25 g 至225 mL灭菌好的无菌水中，于振动器上振荡30 min，制成1∶10 的稀释液，再用无菌水进行梯度稀释，选取适宜的3个梯度，分别吸取1 mL稀释液于灭好菌的培养皿内，及时将冷却至50 ℃左右的培养基注入培养皿充分混匀。待琼脂凝固后，倒置于28 ℃恒温培养箱中培养72 h后，记录培养皿内霉菌总数，并按稀释倍数计算得到每克样品所含霉菌总数。

玉米中脂肪酸含量的测定参照国标GB/T 15684—2015[7]。贮藏应用效果参照国标《玉米储存品质判定规则》进行评定[8]。

1.5 数据统计与分析

数据采用Excel 2007 处理并用SPSS 20.0 进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

2.1.1 临床症状

通过每天定时对试验组和对照组小鼠的精神健康状态观察。结果发现，本试验整个过程中灌服辣椒籽抗菌肽的小鼠和无菌水的小鼠精神状态和采食情况等无明显差异。也没有发现经灌服辣椒籽抗菌肽后小鼠出现明显的表观中毒现象。

2.1.2 半数致死量计算

由表1可以看出，在整个试验期对照组和试验各组均没有出现小白鼠的死亡。抗菌肽一次灌胃剂量达5 g/kg动物体重仍未出现死亡现象，按食品添加剂急性毒性分级标准，抗菌肽属无毒级。因此，该抗菌肽作为添加剂安全使用是可行的。

2.1.3 脏器指数变化

不同剂量辣椒籽抗菌肽处理后对小鼠的脏器指数影响见表1。结果表明灌服辣椒籽抗菌肽组小鼠的肝脏指数、脾脏指数、肾脏指数和对照组相比均差异不显著(P>0.05)，说明在一次性高剂量灌服抗菌肽对脏器形态及重量均无影响。

2.1.4 脏器及组织病理变化

通过观察不同组小鼠的脏器及组织(图1)，结果发现各试验组无脏器出现变性或坏死的发生，且各试验组和对照组间脏器的色泽、形态、质地等均没有差异。由此说明，一次灌服5 g/kg的辣椒籽抗菌肽不会造成脏器和组织的急性病理现象。

表1 小鼠生长体征情况Table 1 The toxicity signs of mice after acute toxicity test

注：料重比表示饲料消耗量与小鼠增重的比值。

图1 小鼠脏器及组织病理变化Fig.1 The toxicity signs of mice organ after acute toxicity test

2.2 亚慢性毒性试验

2.2.1 临床症状

根据整个试验期的观察，结果发经过30 d累计灌服辣椒籽抗菌肽后试验组和对照组大鼠的精神状态等均无明显差异，也未发现连续灌服抗菌肽的大鼠有表观中毒现象。说明从表观症状无法确定辣椒籽抗菌肽是否存在毒害作用。

2.2.2 脏器、组织病理变化观察及脏器指数测定

试验结束后，解剖暴露两组试验大鼠脏器及组织发现同对照组大鼠相比的2组的脏器均未见有明显的脏器及组织病理变化。分离肝脏、脾脏和两侧肾脏，然后称重，计算对照组和试验组的肝脏指数、脾脏指数、肾脏指数，结果见表2。

表2 体重及脏器指标Table 2 Weight and organ indicators

结果发现每天灌服辣椒籽抗菌肽的大鼠和每天灌服等量无菌水的大鼠在脏器指数上均无显著性差异。

2.2.3 增重及饲料利用率

分别统计试验组和对照组每10 d的增重、耗料和饲料利用情况。结果见表3。

表3 抗菌肽对大鼠增重及饲料利用率的影响Table 3 Effect of antifungal peptide on weight gain and feed utilization of SD rats

注：料重比表示饲料消耗量与大鼠增重的比值。下同。

结果表明对照组和试验组之间的饲料消耗、增重和饲料利用率之间均无显著性差异。

2.2.4 对血液常规指标的影响

连续灌服辣椒籽抗菌肽后对大鼠的血液常规指标的影响结果见表4。与对照组相比灌服抗菌肽大鼠组淋巴细胞数和血小板总数有所升高，但与和对照组相比无显著性差异(P>0.05)，说明30 d连续灌服0.3 g/kg体重的抗菌肽对大鼠血液指标无显著影响。

表4 抗菌肽对大鼠血液常规检查结果的影响Table 4 Effect of antifungal peptide on general inspect of blood of SD rats

2.2.5 对血液生化指标的影响

辣椒籽抗菌肽经30 d连续灌喂后对大鼠血液生化指标的影响结果见表5。试验组各指标和对照组相比差异不显著(P>0.05)，但通过数据也能发现试验组血清中的总蛋白、球蛋白和甘油三酯含量略高于对照组。

表5 抗菌肽对大鼠血液常规检查结果的影响Table 5 Effect of antifungal peptide on biochemical of blood of SD rats

2.3 辣椒籽抗菌肽对贮藏玉米中的霉菌总数和脂肪酸含量的影响

霉菌总数和脂肪酸值反映了谷类品质裂变程度[9-12]。采用玉米模拟储藏试验(种子含水量15%，储藏温度28 ℃、储藏湿度75%)，以目前市场上应用较好的防霉剂(丙酸钙、那他霉素)为参照，评价不同浓度辣椒籽抗菌肽在玉米储藏中的效果。玉米储藏20 d后霉菌和脂肪酸值如图2所示，处理前玉米种子霉菌总数小于103CFU/g，脂肪酸值为15，说明原料种子品质较好。但随着储藏时间的延长，对照组中霉菌大量繁殖，总数大幅增加，20 d时已发生霉变，霉菌数量超过106CFU/g，脂肪酸值升到了56 mg KOH/100 g，并出现肉眼可见的霉变特征，色泽气味发生变化。与对照相比，添加不同防霉剂均能有效抑制较高水分玉米储藏过程的霉菌生长，显著降低脂肪酸值。0.3 g/kg的辣椒籽抗菌肽的防霉效果与丙酸钙和那他霉素标准添加量无显著差异(P>0.05)。说明辣椒籽抗菌肽具有开发为新型防霉剂，在农产品安全贮藏中应用的潜力。

对照-无添加；处理1-辣椒籽抗菌肽 0.075 g/kg；处理2-辣椒籽抗菌肽 0.15 g/kg；处理3-辣椒籽抗菌肽 0.3 g/kg；处理4-丙酸钙2.26 g/kg；处理5-那他霉素0.3 g/kg图2 不同防霉剂对贮藏玉米霉菌总数(A)和脂肪酸值(B)的影响Fig.2 Effect of different antifungal agents on mold quantity and fatty acid value of corn

3 讨论

随着人们对食品安全的重视，生物抗菌肽的挖掘和应用，越来越受到科学研究者的青睐。但是，任何新发现或研发获得的新型添加剂的安全问题，不容忽视。在确定其可用于大面积使用之前都必须对其安全性做详细评定，以保证其应用范围和使用剂量。关于抗菌肽安全性的报道，目前大都认为具有安全性和有效性[13-14]，其抗菌肽性已应用在酒[15]、海鲜[16]、畜产品[17]保鲜中，其促生长特性已应用在家畜饲养中[18-19]。但是，研究发现，也有部分多肽类物质在应用过程中产生了不良反应[20-22]。因此课题组分别开展了小鼠急性毒性试验和大鼠亚慢性毒性试验，对辣椒籽抗菌肽的安全性进行评价。结果显示小鼠在最大灌喂量为5 g/kg后也无明显的中毒迹象，依据《食品安全性毒理学评价程序和方法》初步表明其属于安全无毒级别。大鼠连续30 d灌服剂量为300 mg/kg体重的辣椒籽抗菌肽后，对照组相比试验组的各项指标均无显著差异，说明长期连续使用也无慢性毒性作用，安全性好。初步证明辣椒籽抗菌肽是一种无毒物质，其作为农产品防霉剂是安全的。

真菌污染是储存过程中导致谷类及饲料变质的主要原因，并且真菌产生的毒素会对人和动物造成严重的危害[23]。本试验结果表明，不同浓度辣椒籽抗菌肽处理后和对照组相比均能显著降低霉菌总数，这与GUPTA研究的植物乳杆菌产生的抗菌肽对谷物试验室贮藏，以及丛苑研究得芽孢杆菌抗菌肽对玉米实验室贮藏的结果一致[11-12]。其中0.3 g/kg辣椒籽抗菌肽处理后的霉菌总数与那他霉素试验组差异不显著，显著低于丙酸钙试验组，说明辣椒籽抗菌肽具备良好的防霉效果。同时，添加不同浓度抗菌肽都有效的降低了玉米原料中脂肪酸值。国标的谷物储藏判定规则中，脂肪酸值作为玉米的宜存指标，反映了玉米品质劣变程度[8]。微生物活性与玉米品质指标脂肪酸值有着密切关系，霉菌的代谢分泌的脂肪酶促使脂肪水解造成脂肪酸积累，是造成玉米品质劣变的重要因素[24]。白岩对不同储藏温度下高水分玉米微生物活性值与玉米主要品质指标脂肪酸值的变化及其相关性进行了分析，结果表明，微生物活性值与玉米脂肪酸值显著相关，相关系数为 0.786 7～0.992[24]。本试验中霉菌数量与脂肪酸值的相关系数为0.933 6，具有极显著的正相关性(P<0.01)，这说明抗菌肽在降低玉米中霉菌数量的基础上，进而有效减少玉米原料因微生物引起的酸败。其中的辣椒籽抗菌肽(0.15 g/kg、0.3 g/kg)与丙酸钙、那他霉素标准添加量无显著差异(P>0.05)。辣椒籽抗菌肽可有效抑制霉菌生长，降低脂肪酸值，有望开发为新型防霉剂应用于农产品或饲料贮藏中。

以上结果对辣椒籽抗菌肽的推广应用提供了一定的参考数据。但关于辣椒籽抗菌肽在机体内的代谢情况仍需要做进一步研究，以期对辣椒籽抗菌肽的安全性进行全方位的评价，为其将来在食品和畜牧等方面的推广应用提供坚实的理论依据。