MTHFB C677T基因、血清同型半胱氨酸与特发性男性不育症的关系研究

邵丽佳 朱德胜 陈伟 沈利洪

随着人类基因组计划顺利完成及男科学研究迅速发展，与特发性男性不育症相关的基因逐步被发现，其中亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因677位点的单核苷酸突变与男性不育的发生有关[1-4]，该过程可能是由于MTHFR基因位点突变导致高同型半胱氨酸（Hcy）血症，从而导致男性不育[5]。但MTHFR基因与血清Hcy水平之间的关系目前尚缺乏验证，且高Hcy血症与男性不育之间的关系尚存在争议。基于此，本研究通过检测特发性男性不育症患者MTHFR C677T基因型和血清Hcy水平，分析MTHFR C677T基因多态性、血清Hcy水平与特发性男性不育症的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017年4月至2018年9月本院收治的特发性男性不育症患者167例，设为病例组，纳入标准：年龄20～39岁，夫妇婚后同居至少1年、正常性生活未避孕未育、排除女方不孕，无特殊既往史和家族史；排除染色体核型异常，Y染色体无精症因子区微缺失，精索静脉曲张，隐睾，附睾损伤，阻塞性无精症，生殖系统感染。另择同期来院体检，有正常生育史且身体健康者65例，设为对照组，纳入标准：年龄20～39岁，至少生育过1个孩子，身体健康，无特殊既往史和家族史；排除通过辅助生殖技术生育子女者。病例组患者年龄20～39（29.4±3.1）岁，对照组受检者年龄 21～39（28.8±2.8）岁，两组年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经金华市中心医院医学伦理委员会批准，且所有受检者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 精液质量分析 依据WHO第五版《人类精液检查与处理实验室检查手册》，采用CASA计算机辅助精子分析系统，对病例组患者行精液质量分析。精液质量评价指标包括精子总数、精子活力和精子形态，其中精子总数≤39×106/每次射精为精子总数异常，前向精子运动率≤32%为精子活力异常，正常形态精子≤4%为精子形态异常。根据精液质量将特发性男性不育症分为8个亚型：精液质量正常型，仅精子总数异常为少精子症，仅精子活力异常为弱精子症，仅精子形态异常为畸精子症，精子总数和精子活力异常为少弱精子症，精子总数和精子形态异常为少畸精子症，精子活力和精子形态异常为弱畸精子症，精子总数、精子活力及精子形态均异常为少弱畸精子症。

1.2.2MTHFR C677T基因型检测 采用RT-PCR法。抽取病例组患者与对照组受检者2 ml全血至EDTA抗凝试管中，充分混匀后使用北京天根生化科技有限公司生产的TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒抽提全血DNA。使用上海之江生物有限公司生产的MTHFR C677TMutation Real Time PCR Kit试剂盒进行MTHFR C677T基因多态性检测。制作反应体系为40μl。循环参数：37℃ 2min，94℃ 2min，循环 1 次；93℃10s，62℃40s，循环30次。4℃终止。信号收集在62℃。荧光检测通道为FAM和VIC。FAM通道阴性、VIC通道阳性为野生型（CC型），FAM通道和VIC通道均阳性为突变杂合子（CT型），FAM通道阳性、VIC通道阴性为突变纯合子（TT型）。

1.2.3 血清Hcy水平检测 抽取病例组患者与对照组受检者空腹静脉血2ml，用促凝真空管留置静脉血标本，血液凝固后以3 500 r/min离心，使用奥林帕斯AU 5400生化全自动分析仪检测血清Hcy水平。血清Hcy水平≤15μmol/L定义为正常Hcy，血清Hcy水平＞15μmol/L定义为高Hcy血症。

1.3 观察指标 （1）观察病例组患者精液质量分析结果；（2）比较两组对象MTHFR C677T基因型；（3）比较两组血清Hcy水平；（4）比较不同MTHFR C677T基因型的两组血清Hcy水平；（5）单因素分析MTHFR C677T基因型与特发性男性不育症的关系；（6）单因素分析血清Hcy水平与特发性男性不育症的关系；（7）多因素分析MTHFR C677T基因型、血清Hcy水平与特发性男性不育症的关系。

1.4 统计学处理 应用SPSS 21.0统计软件；正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较用Kruskal-WallisH秩和检验，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验，组内同一指标比较用Mann-WhitneyU检验。计数资料以频数和构成比表示，两组比较采用χ2检验，组内同一指标两两比较采用Bonferroni方法进行多重检验校正；采用logistic回归分析MTHFR C677T基因型、血清Hcy水平与特发性男性不育症的关系；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组患者精液质量分析结果 见表1。

表1 病例组患者精液质量分析结果[例（%）]

由表1可见，病例组患者中精液质量正常型13例、少精子症2例、弱精子症37例、畸精子症15例、少弱精子症14例、少畸精子症3例、弱畸精子症62例、少弱畸精子症21例。

2.2 两组对象MTHFR C677T基因型比较 见表2。

表2 两组对象MTHFR C677T基因型比较[例（%）]

由表2可见，两组对象MTHFR C677T基因型分布情况存在统计学差异（P＜0.05），病例组患者TT基因型比例高于对照组。两组对象MTHFR C677T基因的等位基因分布情况存在统计学差异（P＜0.05），病例组患者T等位基因频率高于对照组。

2.3 两组对象血清Hcy水平比较 病例组患者血清Hcy 水平为 13.8（10.4，18.4）μmol/L，对照组受检者血清Hcy 水平为 11.1（9.9，12.4）μmol/L。两组对象血清 Hcy水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），病例组患者血清Hcy水平高于对照组受检者。

2.4 不同MTHFR C677T基因型的两组对象血清Hcy水平比较 见表3。

表3 不同MTHFR C677T基因型的两组对象血清Hcy水平比较（μmol/L）

由表3可见，不同MTHFR C677T基因型的对照组受检者间血清Hcy水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。不同MTHFR C677T基因型的病例组患者血清Hcy水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），不同基因型患者血清Hcy水平两两比较，TT基因型的病例组患者血清Hcy水平高于CC基因型的病例组患者，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5MTHFR C677T基因型与特发性男性不育症的关系分析 见表4。

表4 MTHFR C677T基因型与特发性男性不育症的关系分析

由表4可见，CT基因型的研究对象（包括病例组患者与对照组受检者）患特发性男性不育症的风险是CC基因型的1.46倍，但这一关系无统计学意义（95%CI:0.78～2.74，P＞0.05），而 TT基因型的研究对象患特发性男性不育症的风险是CC基因型的3.63倍（95%CI：1.45～9.06，P＜0.05）。

2.6 血清Hcy水平与特发性男性不育症的关系分析见表5。

表5 血清Hcy水平与特发性男性不育症的关系分析

由表5可见，高Hcy血症者患特发性男性不育症的风险是非高Hcy血症者的24.46倍（95%CI：5.79～103.31，P＜0.05）。

2.7MTHFR C677T基因型、血清Hcy水平与特发性男性不育症的关系分析 见表6。

表6 MTHFR C677T基因型、血清Hcy水平与特发性男性不育症的关系分析

由表6可见，CT、TT基因型研究对象与CC基因型相比，其特发性男性不育症的患病风险增加，但无统计学意义（均P＞0.05）；高Hcy血症仍然是特发性男性不育症患病风险增大的危险因素，OR=22.38（95%CI：5.27～95.128，P＜0.05）。

3 讨论

MTHFR是一种黄素依赖酶，相对分子量为74.5kD，在机体中主要介导5,10-亚甲基四氢叶酸转变成5-甲基四氢叶酸，后者在DNA和蛋白质甲基化的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸的形成过程中发挥关键作用[6]。目前，人类基因组研究已发现MTHFR基因存在多个多态性位点，其中MTHFR C677T为CC型、CT型和TT型，MTHFR的酶活性依次下降[7-8]。

Hcy是一种含硫氨基酸，可在N5-甲基四氢叶酸转甲基酶及其辅酶维生素B12的作用下生成蛋氨酸，也可在胱硫醚-β-合成酶的催化下生成半胱氨酸。Hcy再甲基化时由5-甲基四氢叶酸提供甲基，而MTHFR正是介导5,10-亚甲基四氢叶酸转变成5-甲基四氢叶酸的关键酶。

据中国、德国、印度等多个国家的研究发现，MTHFR C677T位点的单核苷酸多态性与当地人群的男性不育发生存在关系[1-4]。有学者提出，MTHFR C677T位点的突变导致MTHFR基因出现异常，可能引起血液中Hcy的堆积形成高Hcy血症，高Hcy血症会导致男性不育[5]。本研究结果显示，病例组患者TT基因型比例高于对照组，且病例组患者T等位基因频率高于对照组。这说明T等位基因可能是特发性男性不育症的危险等位基因，这一结果与既往研究结果相符[9-10]。

血清Hcy水平与特发性男性不育症之间的关系尚无定论。赵铭佳等[11]的研究发现血清Hcy水平与男性精液量、精子浓度和精子活力均无关系，但戈一峰等[12]、何海洪等[13]的研究提示血清Hcy水平与精子浓度、精子活力均呈负相关。本研究结果显示，病例组患者血清Hcy水平高于对照组受检者。

本研究中，不同MTHFR C677T基因型的对照组受检者间血清Hcy水平比较差异无统计学意义。将MTHFR C677T基因、血清Hcy水平分别与特发性男性不育进行单因素logistic回归分析，结果分别肯定了这两个因素与疾病的关联，但是在多因素logistic回归分析中，高Hcy血症仍然是特发性男性不育症患病的危险因素，而MTHFR C677T基因与患病之间的关系没有统计学意义。这些结果提示，MTHFR C677T基因对血清Hcy水平的影响可能很有限，血清Hcy水平可能受多种因素调节，而真正影响特发性男性不育症的因素更可能是多种因素导致的高Hcy血症，而非MTHFR C677T基因多态性。即血清Hcy水平可能是独立于MTHFR C677T基因的影响特发性男性不育症的因素，且高Hcy血症者的特发性男性不育症患病风险是非高Hcy血症者的22.38倍。

血清Hcy水平影响特发性男性不育症发生的机制可能是体内高Hcy可抑制谷胱甘肽合成，谷胱甘肽为活性氧的清除物质，当谷胱甘肽减少时，精液中活性氧产生与清除的动态平衡被破坏，造成精子生成减少、精子DNA损伤等，最终导致精液质量降低[14]；此外高Hcy血症可能引起睾丸中的血管过早发生动脉硬化，影响睾丸的血液供应，导致生精功能障碍[15]。

综上所述，MTHFR C677T基因的T等位基因、高Hcy血症均是特发性男性不育症发病的危险因素，而血清Hcy水平可能是独立于MTHFR C677T基因的影响特发性男性不育症发病的因素。在常规生育前体检、不育男性检查中增加血清Hcy水平检测可能对特发性男性不育症的病因发现和治疗、实现优生优育有重要的现实意义。