IGF-2在结直肠癌组织中的表达及临床意义

金银 姜亦珍 桂琦

结直肠癌是癌症相关死亡的第三大原因[1]。而胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）与肿瘤发生、发展及转移的关系密切，近年来引起国内外广泛关注。目前有研究提到IGF-2可作为多种肿瘤的预后分子标志物[2]。本文对IGF-2在结直肠癌组织中的表达及临床意义进行分析，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取本院2017年1月至2018年5月确诊为结直肠癌的79例患者，其中男50例，女29例；年龄33～81（64.36±8.95）岁；直肠癌 58 例，结肠癌 21 例；伴有淋巴结转移30例，伴有远处转移13例，无淋巴结及远处转移36例；TNM分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期20例，Ⅲ期17例，Ⅳ期19例。入选标准：（1）经病理学检查确诊为结直肠癌；（2）未行手术、放化疗；（3）病理类型为腺癌。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）合并严重心肺疾病；（3）合并克罗恩病、溃疡性结肠炎等其他肠道疾病。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有患者或其家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 组织标本获取 将术中获取的结直肠癌组织切成0.5cm左右的小块，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 结直肠癌组织中IGF-2 mRNA表达的检测 采用qRT-PCR法。将结直肠癌组织标本56℃液化1h，提取总RNA；取5μl总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测其完整性。逆转录按照BIOMIGA公司逆转录试剂盒说明书合成cDNA，-80℃保存备用。按照美国BIOMIGA公司的SYBR GreenⅠ说明书配制qRT-PCR反应体系，取cDNA进行qRT-PCR。反应条件：95℃预变性10min；95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环。每个样品设置3个复孔。以GAPDH作为内参基因，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。GAPDH引物：正向5′-GAAAAGAAGGACCCCAGAA-3′，反向 5′-TGCTGTGTGTTGTGTGTGTC-3′。IGF-2 引物：正向 5′-CTTGGACTTTGAGTCAAATTGG-3′，反向 5′-GGTCGTGCCAA TTACATTTCA-3′。2-ΔΔCt表示样品中目的基因相对表达量，其中ΔCt=样本Ct均值-内参Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（随机阴性对照样品Ct均值-该样品内参Ct均值）。

1.2.3 结直肠癌组织中IGF-2蛋白表达的检测 采用免疫组化染色法。对结直肠癌组织标本进行固定、浸泡、浸蜡、包埋、切片、脱蜡处理，并将其浸泡于3%双氧水中20min。PBS冲洗组织切片3次以上（＞15min），再将700ml柠檬酸缓冲液（pH6.0）放入烧杯加热；当柠檬酸缓冲液沸腾后，将组织切片置入烧杯内；15min后将组织切片取出，在常温下冷却5min，PBS（pH 7.4）冲洗3次以上（＞15 min）。对组织切片进行一抗处理，并置于4℃冰箱孵育；第2天取出组织切片，PBS（pH 7.4）再次冲洗。对组织切片进行二抗处理，然后常温孵育10min，使用PBS（pH 7.4）进行冲洗。使用二氨基联苯胺显色溶液对组织切片进行显色处理，再用清水进行冲洗；用苏木精对组织切片进行衬染，透明脱水树胶进行封固；染色完成后，在光学显微镜下观察组织切片。IGF-2蛋白表达结果的判定[3]：染色强度无色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞所占比例≤1%为0分，＞1%～10%为1分，＞10%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分；染色强度分值与阳性细胞所占比例分值的乘积＜3分为阴性，3～4分为弱阳性，5分为中等阳性，≥6分为强阳性。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验或单因素方差分析；等级资料的比较采用Mann-WhitneyU检验或Kruskal-WallisH检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织中IGF-2 mRNA表达与患者临床特征的关系 结直肠癌中IGF-2 mRNA表达与TMN分期有关，即分期越高，mRNA相对表达量越高，差异有统计学意义（P＜0.05）；结直肠癌中IGF-2 mRNA表达与患者年龄、性别、BMI、肿瘤部位均无关，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 结直肠癌组织中IGF-2 mRNA表达与患者临床特征的关系

2.2 结直肠癌组织中IGF-2蛋白表达与临床特征的关系 结直肠癌组织中IGF-2蛋白表达与TMN分期有关，即分期越高，蛋白表达越强，差异有统计学意义（P＜0.05）；结直肠癌组织中IGF-2蛋白表达与患者年龄、性别、BMI、肿瘤部位均无关，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 2。

表2 结直肠癌组织中IGF-2蛋白表达与患者临床特征的关系（例）

3 讨论

目前关于结直肠癌的病因不明，其相关危险因素有吸烟、饮酒、高脂肪低纤维饮食、加工红肉或酒精的微生物代谢物介导的肠道菌群改变等[3-5]。结直肠癌是一种可能涉及到多个步骤、多个阶段及多个基因共同参与的细胞遗传学疾病；在细胞发生癌变过程中，逐渐发生基因突变和癌变[6-7]。近年来研究发现，胰岛素、IGF参与肿瘤的发生、发展和转移[8-11]。IGF是一类多肽激素，具有与胰岛素类似的功能和结构[12]。IGF-2是IGF家族中调节生长发育的多肽生长因子之一，在发育过程中通过表观遗传、转录和翻译机制微妙地控制其表达[13]。它是一种7.5KDa的有丝分裂肽激素，主要由肝脏产生，也可自分泌或由旁分泌的组织分泌[14]；它也是胎儿发育的主要生长因子，其mRNA表达在肾、肝组织中均有下调，而通常在癌组织中过表达[14]。

体外实验表明，IGF-2 mRNA一般由乳腺癌成纤维细胞表达，外源性IGF-2可支持人乳腺癌细胞在无血清、无雌激素培养基中旺盛生长[12]。原位杂交研究表明，在乳腺癌中IGF-2 mRNA完全由恶性肿瘤间质表达，与IGF-2蛋白染色密切相关[12]；该研究还表明，IGF-2蛋白在大多数肿瘤的上皮和间质中表达，IGF-2在乳腺癌中的表达与乳腺癌生长与分化的2个重要调控因子有关[12]。IGF-2过表达发生在多数肉瘤中，常伴IGF-2位点印迹丢失；约50%的子宫平滑肌肉瘤IGF-2高表达，对于肿瘤上皮间室IGF-2表达水平高于本研究队列中值的患者，其疾病进展或死亡风险约增加1倍[15]。在上皮性卵巢癌和其他癌症中，胎儿IGF-2启动子的重新激活和IGF-2过表达与预后恶化有关[15]。

本研究结果显示，不同年龄、性别、BMI、肿瘤部位的结直肠癌患者肿瘤组织中IGF-2 mRNA及蛋白表达比较，差异均无统计学意义；但是TMN分期越高，结直肠癌患者肿瘤组织中IGF-2 mRNA及蛋白表达越强。实验表明，IGF-1、IGF-1R、IGF-2R、IGF-2 的表达涉及某些肿瘤的分化和转移，提示分期越高，相对表达量越高。Liu等[16]研究表明，miRNA-30a通过下调IGF-1R抑制结直肠癌转移。IGF-2具有促进细胞有丝分裂、刺激细胞增殖及DNA复制和转录、刺激组织器官生长和分化等作用，IGF-2的促细胞增殖作用不仅体现在正常细胞，也可以通过旁分泌或自分泌方式促进肿瘤细胞的增殖[17]。张德芳[18]研究表明，IGF-2及IGF结合蛋白的表达可能与结肠癌患者的肿瘤分期、临床上常规肿瘤标志物存在一定的联系。高表达的miR-483-5p能通过上调IGF-2基因p3 mRNA转录，以促进肝癌细胞的发生、发展。

综上所述，本研究认为IGF-2可能参与结直肠癌的发生、发展，可为作为预测结直肠癌的一项参考指标。