广枣叶和广枣中黄酮类成份的提取、含量测定的对比实验*

赵冬冬，王瑞芳，何静波，杨玉梅,杜建喜

(1.内蒙古科技大学包头医学院药学院，内蒙古 包头 014040；2.广东海洋大学理学院)

广枣Choerospondias axillaris(Roxb.) Burttet Hill.，又名南酸枣，也叫山枣子，五眼果，鼻涕果，属漆科(Anacardiaceac)，高大落叶乔木[1]。目前，不论是国家药典、还是内蒙古成药标准收载的广枣及广枣制剂，都是指广枣的干燥成熟果实，即广枣[2,3]，其主要活性成分为黄酮类，即广枣总黄酮(Total Flavones of Choerospondias Axillaris Fructus)[4-9]。目前，广枣叶被当作废物丢弃，有关广枣叶化学成分的研究鲜有报道。本文拟从广枣叶中提取总黄酮并与广枣果实进行初步对比。

1 实验材料

1.1药材及试剂 广枣果实，购自广西玉林中药材市场，部分采自于湖南浏阳官桥镇山区与广西容县大荣山区，由广东海洋大学农学院林果专业博士副教授李林峰鉴定为漆木科植物南酸枣的干燥成熟果实；广枣叶，采自湖南浏阳官桥镇山区，经广东海洋大学农学院林果专业博士副教授李林峰鉴定为漆木科植物南酸枣的新鲜叶。芦丁对照品，北京恒远启天化工技术研究院和北京世纪奥科生物技术有限公司联合研制。乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化铝等试剂均为分析纯。

1.2仪器 RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；UV-1780紫外分光光度计(日本岛津)；FA1204B电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)；HH-4数县恒温水浴锅(国华电器有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1实验材料的前处理 将购来的或采集来的广枣及广枣叶，可见光下检查是否霉坏、腐烂或者虫蛀，剔除残品后分别捣碎，保存好，备用。

2.2总黄酮的提取 上述处理过的广枣和广枣叶各称取140 g，分别装在2 000 mL的三脚圆底烧瓶，用8倍量的70 %(v/v)的乙醇进行水浴加热回流提取1.5 h，各平行提取3次，收集各次提取的溶液，过滤除掉药渣，然后在真空旋转蒸发仪浓缩成膏[5,10]。烘箱适温干燥成固体膏状物称量得到果实和叶子的粗出膏分别为14.20 g，40.40 g，粗出膏率分别为10.14 %，28.86 %。

2.3石油醚萃取脱脂 将上述干燥得到的广枣和广枣叶提取物用50 %(v/v)乙醇溶解，然后加入石油醚进行搅拌萃取，萃取多次直至各次提取物醚层无颜色。收集石油醚下层溶液，浓缩干燥[11]，称量，得到广枣和广枣叶萃取脂性成分后干膏各为12.70g，33.39 g，计算得到两者出膏率各为9.07 %，23.85 %。

2.4黄酮类的检识 各取上述经萃取脂性成分后广枣和广枣叶样品甲醇溶液于试管中，分别加入显色试剂，观察各反应的变化现象，显色反应为阳性[12]，见表1。

表1 黄酮类的显色反应

2.5定量测试—标准曲线法定量测定总黄酮含量

2.5.1黄酮最佳吸收波长的选择 在标准曲线法定量测定总黄酮含量前，须要确定黄酮定量测定最佳波长。其方法：取上述萃取后的广枣溶液1mL,按制备标准曲线的操作，实验测得样品在506 nm处有最大吸收值，与文献所述芦丁对照品的最佳测定波长510 nm相近，见图1。本实验对广枣和广枣叶提取总黄酮的测定参考一般黄酮量化分析方法以芦丁为对照品，测定总黄酮含量。

图1 黄酮最佳吸收波长的选择

2.5.2标准曲线的制备 精密称取干燥恒重芦丁对照品10.0 mg，用70 %(v/v)乙醇稀释充分溶解后定容至100 mL容量瓶里。分别量取上述配好的溶液0.0 mL，2.5 mL，5.0 mL，7.5 mL，10.0 mL，12.5 mL于25 mL容量瓶，用移液管吸取70 %(v/v)的乙醇溶液使体积至12.5mL。然后向各容量瓶分别依次加入新配好的1.0mL 5 %μg/mL) NaNO2溶液，摇匀，静置6 min；然后加入1.0 mL 10 % (μg/mL)Al(NO3)3溶液，摇匀,静置6 min 后；加入10.0 mL 4 %μg/mL) NaOH溶液，用70 %(v/v)的乙醇溶液定容至25 mL后摇匀,静置20 min。以试剂作空白，于510 nm处进行定量测定。获得回归方程:A=12.125714×C+ 0.006524r=0.999795，见表2；得到的标准曲线见图2。

表2 芦丁对照品浓度与吸光度

2.5.3广枣和广枣叶提取物含量的测定 精密称取广枣固体膏状样品26.6 mg，广枣叶固体膏状样品11.2 mg分别装于100 mL容量瓶，充分溶解定容，随后各取上述配好的样品溶液2.5 mL装于25 mL容量瓶按标准曲线的制备方法操作，测得广枣的吸光度A=0.027，广枣叶的吸光度A＇=0.041，代入回归方程，计算广枣与广枣叶的总黄酮含量，见表3。

注：广枣总黄酮含量=C×稀释倍数/取样量×出膏率。同样运用该公式计算得到广枣叶总黄酮含量。

2.6方法学考察

2.6.1精密度试验 准确量取对照品芦丁标准溶液1 mL，依照标准曲线制备中方法，显色后在510 nm波长下重复测定5次吸光度结果RSD= 0.69 %。表明本实验所用仪器精密度良好，满足实验含量测定的要求，结果见表4。

2.6.2稳定性试验 取本实验供试品广枣总黄酮提取液10mL，按照绘制的标准曲线方法显色后，分别在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min测定其吸光度，RSD=0.95 % , 数据表明，供试品在30 min内其稳定性良好，结果见表5。

2.6.3重复性试验 取本实验供试品广枣叶总黄酮提取液10mL，进行5次平行吸光度测定实验，RSD=1.06 %，结果表明该实验方法的重现性良好，结果见表6。

2.6.4加样回收率试验 取本实验供试品广枣叶总黄酮提取液1 mL，置于10 mL的容量瓶中，分别加入0.1 mg/mL的标准品溶液1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL，摇匀，按照标准曲线建立的方法显色，测其吸光度，计算回收率。回收率=(实验测值—样品中的总黄酮含量/芦丁标准品加入含量×100 %)，测得平均回收率为98.11 %，RSD=0.83 %(n=6)结果见表7。

表7 加样回收率试验结果

3 讨论

本实验采用回流提取法分别提取广枣叶和广枣果实中的总黄酮类，以芦丁为对照品制作标准曲线，标准曲线法定量测定广枣叶和广枣果实中总黄酮含量。实验结果显示，广枣和广枣叶提取物黄酮类检识反应均呈阳性，广枣叶中总黄酮含量1.745 mg/mL,广枣果实中总黄酮含量0.580 mg/mL。结果表明，广枣叶中也存在总黄酮，且含量高于广枣果实中的总黄酮含量。

广枣总黄酮制剂在医药领域的应用甚广，研制出来的方剂越来越多，应用广泛。随着该植物药用价值进一步发掘，势必对广枣药材原料需求产生新的挑战。因此寻找该药材的替代物和拓展该药材植物新的药用部位就显得非常重要和必要。本研究结果提示，广枣叶有可能成为传统广枣的替代品。