正交实验在蓝莓组培培养基筛选过程中的应用

陶兴魁,高贵珍,张兴桃,王海潮,李秀娟,孔小燕

(宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

蓝莓(Vaccinium Spp)，别名越橘，属于杜鹃花科越桔属，多年生浆果类灌木，果实营养丰富。蓝莓果实中的花青素可以保护眼睛、增强视力[1]，是一种抗养化剂。蓝莓也是一种高纤维食品，对防止人体细胞衰老，预防老年性疾病(心脏病、白内障、癌症、记忆力衰退等)具有特殊功效[2]，因而被国际粮农组织列为五大健康食品之一[3-4]，被誉为“黄金浆果”，在我国具有很好的市场发展前景[5-7]。蓝莓常规繁殖速度较慢，且病毒感染严重，品种容易退化[8-9]，利用组织培养则繁殖速度较快，且能保持品种特性[10]。因此对蓝莓的组织培养及快速繁殖进行了研究，探索了不同培养基、植物激素及pH对蓝莓诱导丛生芽增殖的影响；不同培养基、活性炭含量、激素浓度及pH对试管苗生根的影响，从而获得适合蓝莓快速繁殖各个阶段的最适培养条件。

1 材料和方法

1.1 材料

生长健壮的无病虫害的当年生蓝莓新枝条(宿州市埇桥区西二铺蓝莓苗圃基地)。

1.2 方法

(1)外植体的选择和灭菌。幼嫩枝去掉顶梢，用清水浸泡，催芽，温度控制在20 ℃～25 ℃。当枝条的腋芽萌发后，用自来水冲洗3 h，剪取长1.0～1.5 cm的带腋芽茎段，用清水反复冲洗，然后在超净工作台上用75%酒精溶液处理30 s，无菌水冲洗数次，再用1%升汞溶液浸泡5 min，用无菌水冲洗5～6次，冲洗速度先快后慢。

(2)培养基及培养条件。分别以MS、1/2MS、改良WPM、1/2WPM为基本培养基，增添琼脂粉7.0 g/L，蔗糖20 g/L，培养基灭菌20 min，高压灭菌锅设置为121 ℃、131 Kpa，培养室温度设置为25 ℃。采用L9(34)正交表探究不同培养基、IBA、pH和ZT对外植体芽诱导的影响，实验结果如表1所示；相同pH(5.3)，不同培养基、6-BA、ZT对丛生芽增殖的影响，结果如表2所示；不同活性炭含量、pH、NAA和ZT对试管苗生根的影响，结果如表3所示。

表1 蓝莓丛生芽诱导正交实验因素水平表L9(34)

表2 蓝莓丛生芽的增殖正交实验因素水平表L9(34)

表3 组培生根正交试验因素水平表L9(34)

(3)诱导丛生芽萌发。以正交实验因素水平表为依据，配制9种培养基，在茎段两端剪除多余部分，在无菌条件下将单芽茎段接种于培养基中，每种培养基接种20瓶，每瓶4～5个，重复3次，经过40d培养统计发芽数和计算萌芽率，观察腋芽诱导的效果和新生芽的长势。

(4)蓝莓丛生芽的增殖。将原代培养的芽切割成2 cm左右的段，转入继代培养基中继续培养，每种培养基接种20瓶，每瓶4～5个，重复3次，经过30 d培养统计增殖倍数。

(5)蓝莓试管苗的生根。以改良1/2WPM为基本培养基，选取生长健壮的试管苗剪切成长3 cm的尖梢，接种于生根培养基中，每种培养基接种20瓶，每瓶4～5个，重复3次，经过一个月培养后，观察生根情况。

2 结果与分析

2.1 蓝莓丛生芽的诱导

不同因素对蓝莓诱导丛生芽萌发的影响极差分析如表4所示。由表4可知，3，4，9号培养基中的单芽茎段丛生芽的萌发最多，平均出芽率分别达到60.50%，52.83%和55.83%，存活率比其他培养基都高，并且长势很好;2，6，8号培养基中丛生芽的萌发比较好，平均出芽率值是43.83%～47.17%，但是存活率较低，仅为25%;1，5，7号培养基中丛生芽的萌发次之，平均值分别为28.17%，33.00%和26.67%，存活率在25%～30%之间。

正交试验中，极差R值越大，表明该因素在试验中影响越显著。通过表4极差数据分析表明，R值最大的是B因子，因子A的R值最小，即培养基对单芽茎段萌发的影响最大，而IBA影响最小，依次为培养基>ZT>pH>IBA。单从诱导丛生芽萌发的角度看，根据极差分析的结果可以发现，A1B3C2D3是蓝莓单芽茎段丛生芽的萌发培养基的最佳组合。正交试验是一种均一性设计试验，不可能包含全部处理组合，因此A1B3C2D3在实验中就没有显现出来。为验证A1B3C2D3是最优组合，配制此种培养基20瓶进行验证试验，结果表明，丛生芽的萌发诱导达到85%，明显高于正交表中的9种培养基，从而证明了A1B3C2D3是蓝莓诱导丛生芽萌发的最适培养基，即1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0。

为了进一步探究各处理间及因子水平之间的不同，故进行了方差分析如表5所示。培养基、ZT的F比均大于F临界值，影响因素均达到显著差异(p<0.05)，而且此结果与极差分析的结果相吻合。由此可以得出，诱导蓝莓丛生芽萌发的最适培养基是1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0。

表4 不同因素对蓝莓诱导丛生芽萌发的影响极差分析

表5 不同因素对蓝莓诱导丛生芽萌发的影响方差分析

2.2 蓝莓丛生芽的增殖

不同因素对蓝莓丛生芽增殖的影响的极差分析如表6所示。由表6可知，4，5号培养基中的丛生芽的增殖最多，平均增殖倍数分别达到106.67%和110.58%，存活率也比其他7种培养基都高，存活率分别达到83.33%和87.50%，并且长势很好；3，7号培养基中的丛生芽的增殖比较好，平均增值倍数是90.00%～95.00%，存活率是54.17%～70.83%。1，2，6，9号培养基中丛生芽的增殖不好，平均值分别是62.50%～80.33%，存活率在54.17%～83.33%之间。8号培养基的丛生芽的增殖最低，平均值仅达到39.00%，且长势很不好，存活率也非常低，仅50.00%。

通过表6极差数据分析表明，R值最大的是C因子，因子B的R值最小，即6-BA对丛生芽增殖的影响最大，而ZT影响最小，依次为6-BA>培养基>ZT。单从丛生芽增殖的角度看，从极差分析的结果可以看出，蓝莓丛生芽增殖培养基的最优组合为A2B1C3。为了验证A2B1C3是最优组合，配制此种培养基20瓶进行验证试验，结果表明，丛生芽增殖倍数达到150%，明显高于正交表中的9种培养基，并且根系粗壮，须根比较少，从而证明了A2B1C3是蓝莓丛生芽增殖的最适合培养基，即1/2MS+1.0 mg/L ZT+1.5 mg/L 6-BA。

不同因素对蓝莓丛生芽增殖的影响方差分析如表7所示。由表7可知，因子培养基、6-BA和ZT影响因素均没有达到显著差异(p<0.05)，6-BA的F比值较其他的大。由此可以得出，最适合蓝莓丛生芽增殖的培养基为1/2MS+1.0 mg/L ZT+1.5 mg/L 6-BA。

2.3 蓝莓的组培生根

不同因素对蓝莓组培生根影响极差分析如表8所示。由表8可知，4号培养基中的试管苗的生根数最多，平均生根率是74%，存活率也比较高，达到66.67%，且根不仅粗壮而且比较长；3，8号培养基中试管苗的生根数比较好，平均生根率值是70%；3，8号培养基存活率较2，6，7号培养基的存活率低，但是2，6，7号培养基生根率仅在45%～50%；1，5，9号培养基中试管苗生根数比较少，生根率均值在30%～40%之间，且存活率比较低，存活率均值在29.17%～41.67%。

由表8可知，R值最大的是D因子，因子C的R值最小，即活性炭对蓝莓试管苗生根的影响最大，而pH影响最小，依次为活性炭>ZT>NAA>pH。从极差分析的结果可以得到，蓝莓试管苗生根的培养基的最优组合为A2B3C2D3，在实验中没有显示出来。为了进行验证，配制该培养基20瓶进行了验证实验，结果显示，试管苗生根率发达到86%，明显高于正交表中的9种培养基，从而验证了A2B3C2D3培养基为蓝莓试管苗生根的最适宜培养基，即1.0 mg/L ZT+0.8 mg/L NAA+pH 5.0+0.25%活性炭。

表6 不同因素对蓝莓丛生芽增殖的影响的极差分析

表7 不同因素对蓝莓丛生芽增殖的影响方差分析

表8 不同因素对蓝莓组培生根影响极差分析

不同因素对蓝莓组培生根影响方差分析如表9所示。由表9可知，因子活性炭的F比值大于F临界值，达到显著差异(p<0.05)，因此也可以看出，活性炭是影响蓝莓试管苗生根的主要因素，而且此结果与极差分析的结果相吻合。由此可以得出，蓝莓组培苗生根的最适宜培养基为改良1/2WPM+1.0 mg/L ZT+0.8 mg/L NAA+pH 5.0+0.25%活性炭。

表9 不同因素对蓝莓组培生根影响方差分析

3 讨论与结论

实验利用正交设计进行了极差和方差分析，比较了影响蓝莓增殖的主要因素，以此筛选出了蓝莓组织培养各阶段适宜的培养条件。通过实验得到如下结论：影响诱导蓝莓丛生芽萌发的主要因素是培养基和玉米素(ZT)，通过试验筛选出最适宜诱导蓝莓丛生芽萌发的培养基是1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0，并且蓝莓长势良好，存活率也比较高。筛选出蓝莓丛生芽增殖的最适宜培养基是1/2MS+1.0 mg/L ZT+1.5 mg/L 6-BA，丛生芽增殖倍数高达150%，分化的苗数比较多，生长比较旺盛，植株比较粗，而且比较高。蓝莓试管苗生根的最适宜培养基是改良1/2WPM+1.0 mg/L ZT+0.8 mg/L NAA+pH 5.0+0.25%活性炭，试管苗生根率高达86%，根系比较粗壮，分支多，有利于试管苗移栽成活。

WPM系列培养基在蓝莓初代培养、愈伤组织诱导与分化及丛生芽增殖培养中有较好的培养效果[11]。马怀宇在高丛蓝莓不定芽再生植株的研究中以WPM、1/2WPM为适合培养基[12]，本实验得到的结果诱导蓝莓丛生芽萌发的主要因素是1/2WPM和玉米素，蓝莓丛生芽萌发培养基为1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0，与上述研究结果一致。活性炭在蓝莓试管苗增殖和生根过程中起到很好的调节作用，郑理乔[13]等研究表明，当培养基中加入100～200 mg/L的活性炭时，增殖培养效果好，而且可以防褐化，生根情况最为理想。李华娟[14]等以蓝莓茎段为外植体，研究表明增殖培养基以WPM+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA最佳，生根诱导培养基则以1/2WPM+1.0 mg/L NAA+1.0 g/L活性碳为最好[13]。实验研究表明，在生根培养基中加入0.25%活性炭，试管苗生根率高达86%，根系比较粗壮，分支多，有利于试管苗移栽成活。最适培养基的类型及培养条件与前人研究有所差异，可能是由于蓝莓品种的多样性、基因型的不同、选择的外植体类型差别等因素。以后可以分别对不同品种的蓝莓进行系统深入研究，以期获得不同蓝莓品种适宜的培养基及培养条件。