建立注射用还原型谷胱甘肽钠近红外光谱法快速比对模型的研究

曹霞飞 毛新武 宋安华 肖 剑 戚 平 彭明军 刘 肃

1.广州市食品检验所，广东广州 511405；2.广州市药品检验所，广东广州 510160

注射用还原型谷胱甘肽钠主要成分是还原型谷胱甘肽钠，是人类细胞中自然合成的一种肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，广泛分布于机体各器官内，为维持细胞生物功能发挥着重要的作用。可用于肝损伤及某些药物（化疗药、抗肿瘤药、抗结核药、精神抑郁药、抗抑郁药、扑热息痛）导致的中毒的辅助治疗，另外，还原型谷胱甘肽是常用微整形的“美白针”的主要成分[1-3]，随着现今国内微整形的盛行，注射用还原型谷胱甘肽钠在国内的需求量大，进口量大。不法商家为了暴利而生产出各种假劣药品，严重威胁着群众生命健康。

近红外光是介于可见光（VIS）和中红外（MIR）之间的电磁波，美国材料检测协会（ASTM）定义的近红外光谱的波长范围为780～2526nm（12820～3959cm-1），习惯上又划分为短 波近红外区（700～1100nm）和长波近红外区（1100～2526nm）[4]。一致性检验是一种快捷的图谱比较方法，通过比较待测样品的光谱与已知样品的一组参考光谱是否具有一致性，从而判断待测样品与已知样品是否具有一致的药品质量[5]。

传统的药品质量检测控制方法如色谱法、光谱法等仪器昂贵、操作复杂、检验耗时，试剂量多，样品处理复杂，难以实现在基层药品的现场监督、快速打假。近红外光谱分析技术以其简便、快速、高效、绿色、重复性好、稳定性好、无损分析、应用范围广，可实时在线分析等优点，可应用于药品的定性和定量快速筛查，在药品监管和打假方面发挥着重要作用[6]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

甲、乙两台仪器为同一厂家同一型号：德国 Bruker M atrix-F 型傅里叶变换近红外光谱仪（配有1.5m 长的固体光纤探头，InGaAs 型检测器；OPUS5.0 及7.0 光谱分析软件）。

1.2 试药

在进口药品抽样系统中随机抽取合格的进口样品注射用还原型谷胱甘肽钠，包括Pharminvest SPA 厂家的古拉定14 批，每批6 瓶，共84 个样品和BIOMEDICA FOSCAMA 厂家的泰特两批，每批两瓶共4 个样品。规格及包装均为：0.6g/甁，透明玻璃瓶装。

2 方法与结果

2.1 光谱的采集与处理

实验开始前先进行仪器自检，检测合格后开始采集近红外漫反射光谱。分别用甲、乙两台仪器采集样品，用近红外光谱测样统一程序测定，采集谱图时，先采用隔玻璃瓶底测试法将光纤探头抵住玻璃瓶底采集谱图，波数范围12000～4000cm-1，分辨率8cm-1，每批样品6 瓶，每瓶测定1 次，收集样品编号1～16 光谱信息。然后再采用直接接触样品测试法采集谱图，先将样品玻璃瓶塞拆除，将瓶内粉末整平，用近红外光谱仪光纤探头伸入瓶内，压实粉末，使光纤探头紧贴粉末，测定，收集光谱。

在OPUS 的Setup Conformity Test 模块建模软件中，取8998.9～7795.5 cm-1、7413.6～6985.5 cm-1、 6823.5～4023.1cm-1谱段范围，分别对两种方法采集的谱图信息进行矢量归一化法、一阶导数化法、一阶导数化+矢量归一化法、二阶导数化法等数据预处理后，选择最佳数据预处理方法，建立合格性测试模型。比较两种模型的优劣，确定最佳模型，并进行专属性、耐用性验证。

2.2 结果与分析

甲、乙两台仪器采用隔玻璃瓶底测试法测得古拉定近红外光谱比较及同一仪器古拉定与泰特光谱比较见图1，甲、乙两台仪器采用直接接触法测得古拉定近红外光谱比较及同一仪器古拉定与泰特光谱比较见图2。

图1 隔玻璃瓶底测得各谱图比较图

图2 直接接触测得各谱图比较图

2.2.1 一致性检验光谱预处理方法和建模谱段的选择 由于一致性检验对测试光谱的要求非常苛刻，因此必须对光谱进行一定的预处理，尽量消除各种物理和电子噪音信号的干扰。在不同仪器上测定的近红外光谱图，可能会因仪器条件等原因，导致对同一样品测得的光谱稍有差异，这种差异主要表现为基线的偏移和旋转[7-8]。对于基线偏移，可以通过矢量归一化或者一阶导数化来消除；对于基线旋转，可以采用一阶导数化结合矢量归一化处理来消除，或使用二阶导数化[9-10]。

现分别取隔玻璃瓶底和直接接触测试法两种方式采集不同仪器测得的古拉定谱图进行各种预处理比较，见图3～4。通过对比不同预处理后图谱情况，可以看出，矢量归一化处理后基线的旋转没有消除，一阶导数化结合适量归一化基本消除了基线偏移和旋转带来的影响，而二阶导数化容易放大噪音和散射光带来的影响，因此平滑点不宜太少，设置为13 或17 为宜，也不宜太多，否则会导致平滑掉一些光谱信息。另外，观察不同仪器测得注射用还原型谷胱甘肽钠近红外 图 谱，在8900～7800cm-1、7500～6900cm-1、6500～4000cm-1谱段图谱中均有较丰富的谱图信息。综上所述，要建立一致性检验模型，可选择一阶导数化+矢量归一化预处理方法，平滑点数13或17，谱 段8900～7800cm-1、7500～6900cm-1、6500～4000cm-1。

图3 隔玻璃瓶底测得古拉定谱图预处理比较图

图4 直接接触测得古拉定谱图预处理比较图

2.2.2 建立一致性检验模型和验证 在OPUS的Setup Conformity Test 建模模块中，取古拉定12 批，编号1～12 的光谱信息作为参考光谱分别建立隔玻璃瓶底测试法一致性检验模型（玻璃模型）和直接接触测试法一致性检验模型（非玻璃模型），结果见图5～6。参数设置为：一阶导数化+矢量归一化预处理，平滑点为13，谱段范围 为8998.9～7795.5cm-1、7413.6～6985.5cm-1、6823.5～4023.1cm-1，CI 限度为6。

图5 隔玻璃瓶底测一致性检验模型（玻璃模型）

图6 直接接触测一致性检验模型（非玻璃模型）

另取古拉定2 批，编号13～14 和泰特2 批，编号15～16 的光谱信息作为验证光谱对模型进行专属性验证。见图7～8。

图7 玻璃模型专属性验证结果

图8 非玻璃模型专属性验证结果

取古拉定3 批，采用隔玻璃瓶底测方式，分别用甲、乙两台仪器采集近红外光谱，对玻璃模型进行耐用性验证。见图9。

图9 玻璃模型耐用性验证

3 讨论

采用近红外光谱分析法鉴定进口药品注射用还原型谷胱甘肽钠的近红外漫反射光谱，在OPUS光谱分析软件的Setup Conformity Test 建模模块中，建立Pharminvest SPA 厂家的注射用还原型谷胱甘肽钠合格性测试模型，计算每个波长点吸收度平均值和标准偏差，将吸收度平均值±标准偏差5 倍作为专属性波长点的可信区间（即CI 限度=5），然后根据待测样品光谱CI 值是否超出CI 限度定性真假。

依照国家基本药物和进口药物近红外光谱快速比对模型建模技术规范，建立一致性检验模型，参考样品应至少3～6 批次，参考光谱的数量应至少30 张，方能有较好的代表性[11]。本研究课题实验选用了12 批次作为参考光谱的测定，共测定有144 张光谱，实验按照规范要求进行操作。

从图1～2 可见，不同仪器采集样品的光谱信息有所差异，因为光谱测定时候受影响因素有较多，如仪器噪音、环境温度、样品韩数量等均会影响样品吸光值的变化。因此，每一次的采集谱图都可能发生漂移等变化，经过预处理后，基线漂移可被消除，不影响样品的建模。从图5～6 可见，12 批古拉定所得参考光谱建立一致性检验模型时，参考光谱最大CI 值均在模型设定CI 限度为6 范围内。

模型专属性通常用已知样品的鉴别正确率表示，不仅需要验证真品的鉴别正确率，还需要用别的厂家相同品种样品进行挑战验证，证明模型能区分出不同厂家样品[12-13]。从图7可见，隔玻璃瓶底测得12 批古拉定所得参考光谱建立的快速比对模型进行专属性验证时，同一厂家的古拉定样品光谱最大CI 值均在设定CI 限度6 范围以内，而不同厂家的泰特样品光谱则全部在设定CI 限度6 范围外，结果显示，该快速比对模型专属性可行。从图8可见，直接接触测得12 批古拉定所得参考光谱建立的快速比对模型进行专属性验证时，同一厂家的古拉定样品光谱与不同厂家的泰特样品光谱最大CI 值都在设定CI 限度6 范围内，无法区分出不同厂家的样品，结果显示，该快速比对模型专属性不可行。

模型的耐用性系指在不改变模型参数的情况下，考查正常操作中的微小变化对模型预测结果的影响。从图9可见，不同仪器隔玻璃瓶底测试法采集的古拉定光谱信息，其最大CI 值均在设定CI 限度6 范围内，结果显示，该快速比对模型耐用性可行。

近红外一致性检验模型建模预处理方法有矢量归一化、一阶导数化、一阶导数化+矢量归一化、二阶导数化和二阶导数化+矢量归一化[14-15]。将各预处理方法处理后所建模型进行比较，一阶导数化+矢量归一化预处理所得古拉定样品光谱CI值与泰特样品光谱CI 值相差较大，更显现模型的专属性，见图7。矢量归一化处理所得泰特样品光谱CI 值在CI 限度6 附近，与古拉定样品光谱最大CI 值的差值较小，容易造成混淆，见图10。一阶导数化处理所得泰特样品光谱CI 值基本在CI 限度6 以内，容易与参考光谱混淆，见图11。二阶导数化和二阶导数+矢量归一化预处理所得古拉定和泰特的样品的信息点较分散，不能区分开两个厂家样品，见图12～13。实验证明，建模时采用一阶导数+矢量归一化预处理方法优于其他方法。

图10 矢量归一化模型

图11 一阶导数化模型

图12 二阶导数化模型

图13 二阶导数+矢量归一化模型

实验中每一次实验前均进行仪器自检的校验，信噪比、100%透射线偏差、干涉图高峰最大允许值的能量测试，水蒸汽、聚苯乙烯样品材料在特定峰位最大允许偏差的X 轴频率校准测试，A、B 滤光片最大允许偏差的Y 轴重现性测试均合格。

建模的专属性与建模样品的代表性密切相关，同一品种两个厂家生产的工艺及辅料差异会造成光谱的细微变化。从图6～7 可见，可能由于原料药相同，辅料差异不大，从而使直接接触测试法所建立的快速比对模型无法区分出两个厂家；而使用隔玻璃瓶底测试法时，由于厂家生产工艺存在较明显差异以及外包材工艺的不同从而使隔玻璃瓶底法所建立的快速比对模型能够很好地区分出两个厂家样品。

4 结论

本研究结合药品检验车现场快筛打假特点，采用隔玻璃瓶底测样方式建立进口药品“注射用还原型谷胱甘肽钠”快速比对模型具有绿色、无污染、不损坏产品包装、快速等优点，该方法专属性较好，耐用性可行，可应用于药品快检车现场快筛打假。