应用SNP array检测流产物三倍体

黄伟伟 胡蓉 杨曦 卢建*

(1.广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东 广州 511400；2. 广州体育学院运动辅助器具设计工程技术研究中心，广东 广州 510500；3.河南科技大学医学技术与工程学院，河南 洛阳 471003)

自然流产在临床妊娠较为常见，文献报道自然流产在流产人群中占 10%～15%，多数为早期流产，其中2次及上自然流产的发生率为 2.2%～4.0%[1,2]。50%～60%的妊娠早期流产是由于早期胚胎的染色体异常所致[1,2]。染色体异常主要包括数目异常和结构异常，数目异常主要表现为染色体非整倍体和整倍体。在早期流产中三倍体出现的频率仅次于16-三体[2]，有文献报道早期绒毛、中期羊水、活产新生儿中出现频率分别为 8/10 000、4/10 000及1/50 000[3]。

随着技术进步，染色体微阵列技术(CMA)逐渐用于临床检测。本文应用CMA中的SNP array技术对临床 397 例自然流产组织标本进行检测，对检测结果为三倍体的病例进行回顾性分析，以比较SNP array、array CGH两种基因芯片在流产物三倍体的检测结果的准确性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年6月至2017年10月期间于广东省妇幼保健院就诊，经临床确诊为自然流产的患者共397例。患者年龄在16～54岁之间，平均年龄(30.5±5.4)岁。所有行 CMA 检测的患者均签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 显微镜下从流产物中挑取绒毛，使用QIAGEN公司生产的DNA提取试剂盒QIAamp DNA Blood Mini Kit进行DNA提取。

1.2.2 SNP array检测 用美国昂飞公司生产的cyto750k SNP基因芯片进行SNP array检测，实验过程包括：限制性内切酶酶切、连接、PCR扩增、片段化、标记、芯片杂交、洗站洗涤芯片和芯片扫描。使用chromosome Analysis Suite(ChAS，version2.1)软件进行数据分析，参照DECIPHER、ClinVar、OMIM、DGV等数据库进行判读[4]。

1.2.3 QF-PCR检测 利用QF-PCR对SNP array结果进行验证。QF-PCR 技术通过 STR 位点检测常见非整倍体 13、18、21、X 和 Y[5]。PCR 反 应 体 系 25 μl: PCR mastermix 12.5 μl，Primer mix 7 μl，DNA样品 5.5 μl(10～30 ng)，PCR程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，25 个循环；72 ℃延伸 20 min 。设置阴阳性对照。PCR扩增产物上ABI3500 测序仪进行毛细管电泳检测，然后用 GeneMaker(version2.2.0)软件数据分析。

1.2.4 array CGH检测 对确定为69, XXY和69, XXX三倍体结果的流产物标本，使用安捷伦公司生产的SurePrint G3 Human CGH 8x60K 微阵列芯片进行array CGH检测。实验过程包括：酶切、标记、纯化、芯片杂交、芯片洗涤和芯片。使用Workbench Lite Edition7.0软件进行数据分析，

2 结果

397例自然流产组织标本中共检测出8例三倍体，3例69,XXY，4例69,XXX，1例亚三倍体68,XX。由于正常的二倍体SNP array分析结果只有3条SNP散点带，而69,XXX三倍体结果图中可见4条SNP散点带(图1)，提示三倍体常染色体有4条SNP散点带。图2为1例母体污染的SNP array分析结果则有5条SNP散点带。对提示为三倍体的标本，我们用QF-PCR 进行后续验证，结果如图3所示，可以看出每个STR位点有3个峰面积大致相等的峰或者两个峰面积大致1∶2(2∶1)峰，提示13、18及21号染色体确实为三体。对69,XXY三倍体array CGH检测结果如图4所示，从图上我们只能看出X/Y性染色体异常，而69,XXX三倍体array CGH检测软件显示结果正常。

3 讨论

染色体微阵列分析主要使用的是微阵列比较基因组杂交芯片(array CGH )和单核苷酸多态性微阵列芯片(SNP array)。两者均能检测出染色体拷贝数变异，但SNP array有单核苷酸多态性探针，除了能够检出染色体拷贝数变异外，还能检出纯合状态(AOH)、单亲二体(UPD)和三倍体、一定比例嵌合等[6]。本文分别用SNP array、array CGH基因芯片对流产物三倍体检测，并对其结果进行对比分析。

引起自然流产的常见因素有年龄、遗传、内分泌因素以及解剖的异常等[7]。胎儿染色体异常是引起自然流产最主要的因素，常见的异常染色体有三倍体、多倍体、染色体单体和三体、结构异常等，复发性流产的患者流产物染色体异常发生率较高。本文应用SNP array技术对临床 397 例自然流产组织标本进行检测，共检测出8例三倍体，用QF-PCR对这8例样本进行验证， 与芯片检测结果一致。array CGH技术不能对三倍体进行检测，对于69,XXY三倍体array CGH检测只能提示X/Y性染色体异常，对于69,XXX三倍体array CGH检测显示为46,XX正常；另外array CGH也不能对母体污染进行有效的鉴别，特别是当胎儿标本为46,XX时,母体污染容易忽略。

图1 SNP array结果分析图(69,XXX)

图2 SNP array母体污染结果分析图

图3 QF-PCR结果分析图

图4 array CGH结果分析图(69, XXY)

三倍体在流产胚胎中比较常见，有文献报道三倍体在早期流产中占6.99%[8]。三倍体在早期自然流产中常见，很少在妊娠中期看到，只有极个别患儿出生，一般出生者都是三倍体的嵌合体[9]。三倍体胎儿染色体总数为69条，发生机制可分为双雄受精、双雌受精和正常受精后有丝分裂障碍3种。临床常见的是双雄受精和双雌受精。双雄受精是指一个正常的卵子同时与两个正常的精子发生受精。双雌受精是指一个二倍体的异常卵子与一个正常的精子发生受精，从而产生一个三倍体的合子，称为双雌受精。有文献报道来源于父亲者(双雄受精)染色体核型为69,XXY (占60%) 或 69,XYY(占 3%); 来源于母亲者(双雌受精)染色体核型为 69,XXX(占37%)[10]。本文中69,XXY检测出3例(占37.5%)，69,XXX检测出4例(占50%)，与文献中所占比例有所不同，可能与文献报道的孕周不一致所致[11]。

受基因组印迹的影响，父源或母源性三倍体两者临床表现有所不同。父源性三倍体型其临床特点为：胎儿生长相对良好，头部大小成比例，颈部透明层增厚，囊状大胎盘，面部或颅脑畸形，胎儿手足异常等，约50%以上胎儿表现第3、4指并指畸形，孕妇血清β人体绒毛膜促性腺激素水平升高(β-hCG)。母源性三倍体型其临床表现为：胎盘小且老化早，胎儿严重的不对称性生长，其头部大小正常，但躯体细小，孕妇血清β-hCG水平下降[10,12,13]。对超声检查中发现胎儿明显不对称生长、羊水偏少，尤其是伴有“剪刀手”样并指的胎儿，要考虑三倍体的可能性，同时要注意胎盘情况[11]。除了上述临床特征外，三倍体的胎儿通常患有心脏缺陷、大脑发育异常、肾上腺和肾脏缺陷(囊状肾)、脊髓畸形(神经管缺陷)等。一些低比例三倍体嵌合体患儿能成长至成年，但伴有发育迟缓、学习困难、癫痫发作、听力丧失和其他临床症状[14]。

胚胎染色体异常是导致胚胎早期流产的最主要原因，约占50% ～60%[1,2]。对流产物行SNP array检测，几乎能够检测出所有种类的染色体异常，是流产物染色体检测的有效手段，除了能检测出三倍体外，还能检测出多倍体、单体、三体、不平衡易位、染色体缺失或重复、纯合状态(AOH)等。然而CMA也有其自身技术的局限性，并不能检测出平衡易位、倒位、插入等染色体拷贝数未发生改变的异常[15]；此外CMA也不能检测出低比例嵌合。而传统的G显带染色体核型分析是细胞遗传诊断的“金标准”，能检测出一定比例的三倍体，但流产标本易发生细菌污染，培养失败的比例较高[7]，而且检测周期长，现在较少用于流产物染色体检测。流产物FISH、QF-PCR检测成本低，能对常见的引起流产的几条染色体快速检测，但只能对少数几条染色体进行检测，而SNP array能实现对全部染色体扫描。发生自然流产时，流产物进行染色体微阵列分析，对评估再生育风险具有重要意义。