柿树根际嗜铁细菌地衣芽孢杆菌CAS20的分离鉴定

王涤非 侯长明 张坤鹏 王洁 艾呈祥 余贤美

摘要：采用CAS检测平板法，从柿树根际土壤中分离获得一株具有较强产嗜铁素能力的细菌菌株CAS20。根据菌株在LB固体培养基上的培养特征和生理生化特性，将其初步鉴定为芽孢杆菌（Bacillus）;经16S rDNA序列分析，CAS20的16S rDNA基因序列（KY199559）与地衣芽孢杆菌（Bacillus. licheniformis）代表菌株ATCC14580的16S rDNA 序列（NR_074923）具有99.93%的相似性，并且位于系統进化树的同一分枝。据此，将菌株CAS20鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

关键词：柿树根际土壤;嗜铁细菌;地衣芽孢杆菌;生理生化特性;16S rDNA 序列分析

中图分类号：S154.39文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）04-0065-04

Abstract The bacterium strain CAS20 producing siderophore was isolated from persimmon rhizosphere by CAS agar plate assay， and was identified as Bacillus based on the cultural characteristics on LB agar plate and physiological-biochemical characteristics. The 16S rDNA sequence analysis showed that the 16S rDNA sequence （KY199559） of CAS20 shared the identity of 99.93% with that of Bacillus.licheniformis strain ATCC14580 （NR_074923）， and they were located on the same branch of the phylogenetic tree. So the bacterium strain CAS20 was identified as Bacillus licheniformis.

Keywords Persimmon rhizospheric soil; Bacteria producing siderophore; Bacillus licheniformis; Physiological-biochemical characteristic; 16S rDNA sequence analysis

芽孢杆菌（Bacillus sp.）能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的强抗逆性内生芽孢，具有抑菌谱广、易于产业化、易于存活和定殖等优点，对多种植物病害具良好防效，能促进植物生长、提高作物产量，在生防领域占有重要地位，许多性状优良的芽孢杆菌菌株已被成功应用于植物病害的防治，具有广泛的应用前景[1-4]。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种常见的芽孢杆菌，革兰氏阳性，在促进植物生长和防治植物病害领域有非常突出的应用价值，是理想的生防菌筛选对象[5-8]。

本研究采用CAS检测平板法，从柿树根际土壤中分离获得一株嗜铁细菌菌株CAS20，通过生理生化特性及16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为地衣芽孢杆菌，可为柿树病害的防治提供生防菌资源。

1 材料与方法

1.1 土样采集

从山东省果树研究所万吉山柿树试验基地采集柿树根际土壤，带回实验室备用。

1.2 嗜铁细菌的分离筛选

采用CAS检测平板法[9，10]进行细菌菌株的筛选和纯化，根据CAS检测平板中橘黄色晕圈的有无及大小，筛选出产嗜铁素能力较强的菌株。

1.3 菌株的鉴定

1.3.1 生理生化特性 将获得的菌株在LB平板上划线接种，于37℃倒置培养24 h，观察菌落形态。菌株的生理生化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》[11]进行分析。

1.3.2 分子鉴定 通过16S rDNA序列分析对获得的菌株进行分子鉴定。所用引物为细菌16S rDNA通用引物[12]，P1F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，P2R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。以37℃振荡培养过夜的菌液为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃ 5 min;94℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环;72℃10 min。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物质量，并回收PCR产物，委托上海生工生物工程有限公司进行16S rDNA测序。利用NCBI的Blastn搜索数据库和DNAssist软件进行序列同源性比较分析，并采用DNAMAN 5.0软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株CAS20的获得

经CAS检测平板筛选及纯化，从柿树根际土壤中获得一株具有较强嗜铁能力的细菌菌株CAS20。该菌株在蓝色CAS检测平板上产生明显的橘黄色晕圈，嗜铁圈直径为3.65 cm（图1）。

2.2 CAS20的生理生化特性

在LB固体培养基平板上，CAS20菌落呈乳白色，边缘不整齐，直径2～6 mm，细胞呈杆状，能在20～41℃条件下生长。CAS20的生理生化特性测定结果见表1。根据菌株在LB培养基平板上的培养特征和生理生化特性，将CAS20初步鉴定为芽孢杆菌（Bacillus）。

2.3 CAS20的分子鉴定

通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，获得长约1 500 bp的片段，经测序，该片段长为1 542 bp。经Blastn搜索，CAS20与地衣芽孢杆菌B. licheniformis菌株ATCC14580（NR_074923）的16S rDNA 序列仅有1个碱基的差异，具有99.93%的相似性（图2），而且两者位于系统进化树（图3）的同一分枝。因此，将CAS20鉴定为地衣芽孢杆菌（B. licheniformis），并将其16S rDNA序列提交到GenBank，登录号为KY199559。

3 讨论与结论

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）可产生孢子抵抗恶劣环境、稳定性强，产生的生物活性酶、抗菌肽、杆菌肽等多种抗性物质直接抑制病原菌生长，或诱导植物对病原菌的防御反应提高植物的病害防治效果，还可促进作物生长，提高作物产量[5-8，13]。该菌近年来受到越来越多的关注，是理想的生防菌筛选对象。

嗜铁细菌通过分泌嗜铁素，与植物根际病原微生物争夺铁营养，从而抑制病原微生物生长繁殖，起到生物防治作用;同时，植物可利用嗜铁细菌产生的嗜铁素所螯合的铁，改善植物的铁营养，促进植物生长，并防治碱性缺铁土壤植物的缺铁失绿症[9，10]。嗜铁细菌分泌的嗜铁素可富集蓝色CAS检测平板中的铁离子，在菌落周围形成橘黄色晕圈[9]。

本试验从柿树根际土壤中分离得到一株细菌菌株CAS20，在CAS检测平板上产生的嗜铁圈直径为3.65 cm，具有较强的产嗜铁素能力。经LB固体平板培养、生理生化特性分析及16S rDNA序列分析，将CAS20鉴定为地衣芽孢杆菌（B. licheniformis），其16S rDNA基因序列（KY199559）与地衣芽孢杆菌代表菌株ATCC14580的16S rDNA 序列（NR_074923）仅有1个碱基的差异，具有99.93%的相似性，且两株菌位于系统进化树的同一分枝。有关菌株CAS20在防治植物病害和促进植物生长方面的作用，还有待于进一步研究。

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