‘泰山红’石榴果实花色苷和类黄酮含量变化

朱峰 冯立娟 尹燕雷

摘要：本试验以‘泰山红石榴为材料、利用高效液相色谱法，研究了石榴果实发育过程中果皮和果汁中类黄酮及花色苷含量的变化。结果表明：石榴果皮、果汁中类黄酮和花色苷含量有差异，果皮高于果汁，均检测到5种类黄酮物质和6种花色苷物质，其中杨梅酮是主要的类黄酮物质，飞燕草-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-葡萄糖苷是主要花色苷物质。果皮中类黄酮总量变化趋势是先下降后上升再下降，成熟期含量为21.70 mg/100g;果汁中类黄酮总量是先上升后下降，在8月29日达到最高值10.42 mg/100g，成熟期时降至2.26 mg/100g。果皮中花色苷单糖苷含量上升，双糖苷下降，果皮中花色苷总量整体呈上升趋势，成熟时达49.63 mg/100g;果汁中花色苷总量也是持续上升，后期增长较快，成熟期时达到最高25.06 mg/100g。石榴果实发育过程中，相同部位的类黄酮和花色苷组分含量变化不完全相同，同种类黄酮和花色苷组分在石榴果实不同部位含量变化也不完全相同，果实着色初期同时积累类黄酮和花色苷，类黄酮含量较高， 到果实成熟后期主要为花色苷的合成。果皮花色苷总量与果皮中PAL显著正相关，果皮、果汁花色苷总量与总糖含量极显著相关。果皮、果汁中花色苷与类黄酮总量均是负相关关系。

关键词：石榴;类黄酮;花色苷;HPLC

中图分类号：S665.401文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）04-0044-07

Abstract ‘Taishanhong pomegranate was selected to analyze the content changes of flavonoids （FLs） and anthocyanins （ACs） in fruit peel and juice during fruit development by HPLC. The results showed that the contents of FLs and ACs in peel and juice were different， and their contents in peel were higher than those in juice. Five FLs and six ACs were detected out in peel and juice， in which，myricetin was the major FL，and delphinidin 3-glucoside and cyanidin 3-glucoside were the major ACs. In peel， the trend of total FLs content firstly decreased then increased， and then decreased. The total FLs content was 21.70 mg/100g at mature stage. In juice， the trend of total content of FLs firstly increased and then decreased. The total FLs content reached the maximum （10.42 mg/100g） on August 29， and fell down to 2.26 mg/100g at mature stage. In peel， the content of AC glucoside fell and that of AC diglucoside rose. The total ACs content had a rising trend， and it was up to 49.63 mg/100g at mature stage. In juice， the total ACs also continued to rise， and had a rapid growth in latter period. The total content reached the maximum （25.06 mg/100g） at mature stage. The content changes of FL and AC componemts in the same part were different during the fruit development， and the content change of the same kind of FL and AC components in peel and juice were also different. FLs and ACs accumulated synchronously at the early fruit coloring stage， and ACs was the main one accumulated at the fruit ripe stage. Total ACs content and PAL were significant correlated at the 0.05 level in peel. Total ACs in peel and juice had significant correlation with total sugar content at the 0.01 level.Total ACs and total FLs contents in peel and juice were negatively correlated.

Keywords Pomegranate; Flavonoid; Anthocyanin; HPLC

石榴（Punica granatum  L. ）屬石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica L.）落叶灌木或乔木，具有较高的食用、药用及观赏价值。石榴适合种植于半干旱气候温和地带和亚热带气候地区，阿富汗、伊朗、中国、美国等国家均有栽培。中国石榴栽培历史悠久，据不完全统计，目前，栽培面积在16万公顷左右，形成了山东枣庄、陕西临潼、新疆叶城、云南蒙自、四川会理、河南开封、安徽怀远等石榴适生栽培区。

类黄酮、花色苷广泛存在于水果和蔬菜中，是人类膳食不可缺少的組成部分，具有抗氧化、消炎、抗癌等生理功能[1，2]。类黄酮包含花色苷。花色苷能够吸引动物进行受粉和种子传播，可用于食品、化妆品和药物糖衣的着色等方面。类黄酮、花色苷是影响石榴果实着色的主要物质，除影响果实外观品质外，还与果实内在品质、营养价值具有极高的相关性。前人对石榴类黄酮、花色苷的研究开展较早，但主要是对其总量的测定[3，4]，对花色苷组分的研究也主要集中在果汁中[5-7]，对果皮类黄酮、花色苷组分及含量的报道也有所涉及[8，9]。但同时对石榴果皮和果汁中类黄酮和花色苷物质动态变化规律的研究鲜有报道。本研究以‘泰山红石榴为试材，利用HPLC技术，分析石榴生长发育过程中果皮、果汁中类黄酮和花色苷物质组分及含量的动态变化及差异，旨在了解石榴果实类黄酮、花色苷物质的变化特点，以期为石榴果实类黄酮和花色苷物质的形成、积累和转化研究提供一定的参考，同时提高对石榴果皮着色和果汁营养价值的认识。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种‘泰山红定植于万吉山基地石榴种质资源圃。该资源圃立地条件、管理水平一致。选取长势良好、树冠大小基本一致的植株，于2017年8月8日到9月19日从树冠不同方向采集大小基本一致的石榴果实，每隔7天采样一次，每次采集20个果实。采后低温条件下带至山东省果树研究所观赏园艺室，将果皮和籽粒分开，籽粒手工压榨后经三层纱布过滤得到果汁。

1.2 主要试剂

类黄酮标准品杨梅酮购自Sigma公司，芹菜素购自ChromaDex公司，槲皮素、木犀草素和山奈素购自中国药品生物制品检定所。花色苷标准品飞燕草-3-葡萄糖苷和飞燕草-3，5-二葡萄糖苷购自ChromaDex公司，天竺葵-3-葡萄糖苷和矢车菊-3，5-二葡萄糖苷购自Sigma公司，矢车菊-3-葡萄糖苷购于Polyphenols公司，天竺葵-3，5-二葡萄糖苷购于Fluka公司。甲醇和甲酸均为色谱级，水为Milli-Q超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 类黄酮的提取 取0.5 g果皮和10 g果汁，分别放入40 mL的62.5%甲醇水溶液中，添加BHA（2 g/L），仔细加入6 mol/L HCl 10 mL，使总体积达到50 mL;置于90℃水浴中回流2 h，冷却至室温，超声处理5 min。取5 mL提取液经0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC测定。

1.3.2 花色苷的提取 取1 g果皮和10 g果汁，分别加入8 mL 4℃预冷的0.1%盐酸甲醇溶液，置于黑暗处浸提24 h，超声提取15 min，14 000 r/min、4℃离心15 min，收集上清液，定容至10 mL。取5 mL溶液经0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC测定。

1.3.3 HPLC分析 采用Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备Agilent 1260 VWD可变波长检测器。色谱柱为ZORBAX SBC18柱 （150 mm×4.6 mm， 5 μm ），柱温30℃。采用2%甲酸（A液）和甲醇溶液（B液）为流动相，进样量为10 μL。其中类黄酮分析时的流速为0.8 mL/min。梯度洗脱程序：0～45 min，80%A液、20%B液;45～60 min，20%A液、80 %B液。检测波长为355 nm。花色苷分析时的流速为1.0 mL/min。梯度洗脱程序：0～15 min，80%A液、20%B液;15～20 min，65% A液、35% B液;20～24 min，80% A液、20% B液。检测波长510 nm。

1.3.4 类黄酮和花色苷的定性及定量分析 定性分析根据标准品的保留时间确定;定量分析采用标准曲线法;类黄酮和花色苷总量为各组分含量的总和。

1.3.5 PAL活性和总糖等测定 PAL活性测定参照王慧聪等[10]的方法;总糖采用蒽酮比色法[11];总酸采用酸碱滴定法[11];可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法[11];采用手持式折光仪测定可溶性固形物含量（GB/T 12295-1990）。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2007进行数据整理，利用DPS 7.05进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 石榴果实中类黄酮和花色苷的定性分析

在建立的色谱条件下，分别取10 μL成熟期（9月19日）的果皮、果汁类黄酮和花色苷提取液进样，得到果皮、果汁中类黄酮和花色苷的色谱图。将样品保留时间与标准品相对照，对样品中类黄酮和花色苷组分进行定性分析，可得出杨梅酮、槲皮素、木犀草素、山奈素、芹菜素的保留时间分别为18.313、23.011、24.678、27.478、28.234 min;果皮、果汁中均可检测到上述5种类黄酮物质;果汁中的类黄酮物质未知峰明显比果皮中的多（图1），表明果汁中类黄酮物质更多样化。

在本试验条件下，对花色苷组分进行定性分析，结果如图2所示，飞燕草-3-葡萄糖苷、飞燕草-3，5-二葡萄糖苷、矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3，5-二葡萄糖苷、天竺葵-3-葡萄糖苷、天竺葵-3，5-二葡萄糖苷的保留时间分别为3.241、4.539、6.030、7.163、9.204、11.437 min。果汁中检测到上述6种花色苷物质，果皮中仅检测到其中5种，未检测到天竺葵-3，5-二葡萄糖苷。

2.2 石榴果实发育过程中类黄酮含量变化

杨梅酮是其主要的类黄酮物质。在果实整个发育期内，杨梅酮含量先下降后上升，9月5日达到23.02 mg/100g，后持续下降至8.60 mg/100g;槲皮素含量呈先上升后下降再上升的变化趋势;山奈素含量呈先下降再上升再下降的变化趋势;木犀草素与芹菜素变化趋势相同，都是先升高后降低，其中木犀草素在果实发育过程中含量较低。成熟期的果皮中类黄酮组分含量依次是杨梅酮（8.60 mg/100g）>槲皮素（7.02 mg/100g）>芹菜素（3.61 mg/100g）>山奈素（2.12 mg/100g）>木犀草素（0.35 mg/100g）。9月5日后，杨梅酮、木犀草素、山奈素、芹菜素含量下降较为明显。果皮中类黄酮总量变化趋势为先下降后上升之后再下降，其在成熟期含量为21.70 mg/100g。

果汁中类黄酮各组分含量明显低于果皮。果汁中杨梅酮、槲皮素、木犀草素含量均呈先上升后下降的变化趋势，山奈素和芹菜素含量则呈先上升后下降再上升再下降的变化趋势。其中杨梅酮含量最高，并在8月29日达到最高值，为8.31 mg/100g，之后果汁中各组分含量均逐渐下降。成熟期各组分含量依次为杨梅酮（1.71 mg/100g）>槲皮素（0.23 mg/100g）>木犀草素（0.18 mg/100g）>芹菜素（0.11 mg/100g）>山奈素（0.03 mg/100g）。果汁中类黄酮总量的变化趋势为先上升后下降，在8月29日达到最高值10.42 mg/100g，成熟期时降至2.26 mg/100g。

2.3 石榴果实发育过程中花色苷含量变化

果皮中6种花色苷组分含量变化结果如表2所示。在果实发育过程中，各组分含量变化存在一定差异。飞燕草-3，5-二葡萄糖苷小幅上升后，逐步下降;矢车菊-3，5-二葡萄糖苷先上升，8月29日达到最高值（2.32 mg/100g），之后下降;而天竺葵-3，5-二葡萄糖苷整个发育过程中含量较低，从0.98 mg/100g持续下降至检测不到。飞燕草-3-葡萄糖苷由最初的0.88 mg/100g平稳上升至成熟期的14.09 mg/100g;矢車菊-3-葡萄糖苷持续上升至成熟期的34.01 mg/100g，明显高于其它组分;天竺葵-3-葡萄糖苷在整个过程中含量均较低。成熟期各组分含量依次是矢车菊-3-葡萄糖苷（34.01mg/100g）>飞燕草-3-葡萄糖苷（14.09 mg/100g）>天竺葵-3-葡萄糖苷（0.78 mg/100g）>飞燕草-3，5-二葡萄糖苷（0.45 mg/100g）>矢车菊-3，5-二葡萄糖苷（0.30 mg/100g）。随着果实的成熟，果皮中单糖苷含量上升，双糖苷含量下降，果皮中花色苷总量整体呈上升趋势，8月29日时增幅较大，表明此时为花色苷的快速增长期。

果汁中各组分含量变化与果皮有所不同（表2）。飞燕草-3，5-二葡萄糖苷含量先上升，达最高值（5.22 mg/100g）后一直下降;矢车菊-3，5-二葡萄糖苷呈先下降后上升再下降再上升的趋势，但变化过程较平缓;天竺葵-3，5-二葡萄糖苷含量较低，且持续下降至0.01 mg/100g。矢车菊-3-葡萄糖苷和天竺葵-3-葡萄糖苷含量均是先下降后上升的变化趋势，而飞燕草-3-葡萄糖苷含量则持续上升，且这三个组分在9月5日增幅较明显。成熟期各组分含量依次是飞燕草-3-葡萄糖苷（12.01 mg/100g）>矢车菊-3-葡萄糖苷（9.15 mg/100g）>飞燕草-3，5-葡萄糖苷（2.62 mg/100g）>矢车菊-3，5-二葡萄糖苷（1.23 mg/100g）>天竺葵-3-葡萄糖苷（0.04 mg/100g）>天竺葵-3，5-二葡萄糖苷（0.01 mg/100g）。果汁中花色苷总量呈持续上升趋势，且后期增长较快，成熟时达到最高（25.06 mg/100g）。

2.4 石榴果实发育过程中其它指标变化和相关性分析

由表3看出，果皮中PAL活性总体上呈先上升后下降再上升的变化趋势;果汁中则是先下降后上升再下降再上升再下降，并在8月29日达到最高峰。随着果实的成熟，果汁中总糖和可溶性蛋白含量整体是上升趋势，总酸含量则持续下降至趋于平稳，可溶性固形物含量稳步上升，成熟期稍有下降。

3 讨论与结论

果实中的类黄酮一般显黄色或无色，在红色果实中作为辅助色素构成果皮的颜色，成熟期含量升高会影响果实红色的表现效果，成熟时几种色素物质同时存在，但果皮颜色主要由花色苷含量决定。随着石榴果实的成熟， 果皮逐渐呈现红色， 花色苷大量积累。本研究发现，‘泰山红石榴成熟时果皮中花色苷总量高于类黄酮总量，其中含6种花色苷组分。Fischer等[12]在石榴果皮中检测到共9种花色苷物质;而Gil等[5]检测到了矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3，5-二葡萄糖苷、天竺葵-3-葡萄糖苷、天竺葵-3，5-二葡萄糖苷4种花色苷。本研究与其不同的是在果皮中检测到了飞燕草素。造成这种差异的原因可能与栽培品种、地理区域或者发育阶段不同有关。本试验成熟期时，‘泰山红石榴果皮中矢车菊-3-葡萄糖苷和飞燕草-3-葡萄糖苷含量占到花色苷总量的96.92%，对果皮着色起主要作用。

本研究在‘泰山红石榴果汁中共检测到5种类黄酮（杨梅酮、芹菜素、槲皮素、山奈素和木犀草素），这与郭长江等[4]的检测结果相同;还检测到6种花色苷物质（天竺葵素、矢车菊素和飞燕草素的单糖苷和二糖苷），该结果与Mousavinejad等[7]的一致。石榴果汁中 6 种花色苷的含量随果实成熟程度而增加，成熟早期3，5-二葡萄糖苷是主要的花色苷，其中飞燕草素衍生物是主要成分;成熟后期单糖苷的含量不断增加，达到甚至超过双糖苷，矢车菊素衍生成为其主要成分[13]。此外，本研究还发现石榴果汁花色苷组分双糖苷呈下降趋势，而单糖苷呈上升趋势，成熟期主要组分是飞燕草和矢车菊的单糖苷，占到果汁花色苷总量的84.44%，对于果汁的营养和着色起主要作用。

鞠志国等[14]研究发现，苹果果皮花色苷的合成与类黄酮、酚类物质的合成途径几乎同时存在而又相互制约。闫忠业等[15]则认为，苹果中花色苷含量变化与类黄酮和总酚含量之间没有显著的相关性，随花色苷含量积累类黄酮和总酚含量稳定。而薛晓敏等[16]指出桃果皮花色苷含量与类黄酮呈极显著负相关。本研究中石榴花色苷总量与类黄酮的总量是负相关，但并不显著，果实着色初期同时积累类黄酮和花色苷，此时类黄酮含量较高， 到果实成熟后期主要为花色苷。在花色苷上升幅度较大的时间段，类黄酮含量下降。由于石榴中存在着大量的酚类物质，这些酚类物质主要通过苯丙基代谢途径合成，其中黄烷酮在黄烷酮3-羟化酶（F3H）的催化下形成二氢黄酮醇类产物，这些产物为黄酮醇、类黄酮、花色苷等代谢支路提供前体物[17]，因而，在石榴果实发育过程中，由于多个代谢支路的共存，类黄酮、花色苷之间存在着底物竞争关系，造成了类黄酮与花色苷含量之间的消长变化。

花色苷生物合成相关酶有 11种，目前大多数集中在PAL、CHS、DFR和UFG等酶上。PAL是催化合成反应的第一个酶。本试验中，石榴果皮中花色苷总量与果皮PAL活性显著相关，在果汁中并不显著。PAL与花色苷积累关系存在一定的争议性。Arakawa[18]研究表明PAL是花色苷合成的關键酶，花色苷的合成需要光，PAL是光诱导酶，能阻止戊糖代谢中形成的苯丙酮酸与氨结合生成苯丙氨酸，不让其向形成蛋白质方向发展，而是朝着合成花色苷的方向进行。也有人认为PAL不是花色苷合成的关键酶[14] ，他们认为PAL虽然是催化花色苷合成第一步反应的酶，但该途径的最终产物包括多种成分，如类黄酮、花色苷、木质素、单宁、角质等，因此PAL活性与花色苷之间的关系要受到其它产物合成速率的影响。

糖酸、可溶性蛋白、可溶性固形物含量是影响果实品质的重要因素，也是育种中衡量石榴果实性状的重要指标之一[19]。随着果实的成熟，果汁中总糖和可溶性蛋白含量是持续上升的，而总酸含量持续下降趋于平稳。果实成熟是糖分不断积累、酸度逐渐下降的过程，总酸含量下降的部分原因可能是因为果实增大和水分含量增加引起的稀释作用，更主要是与酸代谢有关。花色苷是在糖代谢的基础上由苯丙酮酸和乙酸缩合而来，细胞中花色苷的合成必须以足够含糖量为条件[20]。本研究中，果皮、果汁花色苷含量与可溶性总糖极显著相关，说明糖的积累为花色苷的形成提供了前体物质。富士苹果果皮的花色苷含量和着色度与果肉还原糖和可溶性糖含量显著正相关[21]。但是，也有研究得出与上述相反的结果。套袋处理后果实的糖含量降低，却明显促进着色[22]。这说明糖分只在一定范围内限制着色。总之，花色苷的形成必须有糖的存在，但含糖量对花色苷的影响还会受到其他因素的制约。

综上，本研究揭示了石榴果实发育过程中类黄酮和花色苷的一些变化规律，石榴类黄酮和花色苷具有组织差异性，该结果有利于加深人们对石榴果实各部分营养价值的认识，为石榴的育种工作和综合开发利用提供理论依据，而石榴果实黄酮醇、花色苷、类黄酮代谢的调控途径、机制以及类黄酮、花色苷含量变化相关酶活性方面的问题，均有待进一步研究。

参 考 文 献：

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