高原储存悬浮红细胞的质量评价

高锋华，郑焕瑛，王福梅，王艳冰，高 亮，徐旭东，王 钰，张 权，周 虹，蒋兴伟，任素萍，5，于 群，5

（1.军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所，北京 100850；2.解放军第九五〇医院，新疆 喀什 844900；3.山东安丘市人民医院，山东 安丘 262100；4.西藏阿里军分区留守处卫生所，新疆 喀什 850000；5.北京航空航天大学大数据精准医疗高精尖创新中心，北京 100083）

在生物医学领域，将海拔＞3000 m的面积广阔的地区称为高原地区［1］。我国高原面积广阔，尤其是青藏高原，总面积约250万km2，是我国面积最大的高原，海拔在3000～5000 m 之间，平均海拔≥4000 m，被称为“世界屋脊”，具有低氧、低压、低温和强紫外线等特点［2-3］。由于高原地区环境特殊，人口稀少，导致血源有限；近年来平原地区赴高原地区的游客数量逐年上升，亦造成意外用血需求增加，致使当地有限的医疗资源尤其是血液储备量面临巨大的挑战［1，4］。为缓解这一问题，需要将平原地区的血液调入高原地区储存。

相对于成分复杂的血液，成分血具有节约血源、针对性强及便于储存和运输等优势，是目前临床常用的输血类型。悬浮红细胞（suspended red blood cells，SRBC）是全血经离心除去大部分（90%）血浆后，加入红细胞储存液制备而成，是目前国内外应用最广泛的成分血。我国现行标准《全血及成分血质量要求》（GB18469-2012）对正常大气压下静置的4℃储存血质量有明确规定：全血和成分血在4℃条件下储存期末溶血率＜RBC 总量的0.8%，解冻去甘油RBC 游离血红蛋白（hemoglobin，Hb）浓度≤1 g·L-1。血液在储存过程中可能产生的质量问题包括代谢和生理性变化，其中代谢变化如pH值下降、三磷酸腺苷和2，3-二磷酸甘油酸含量降低，以及细胞外K+累积等；生理变化如细胞渗透脆性增加等生物力学的改变［5-7］。高原地区受环境等不确定因素影响，往往无法满足常规储存血液储存条件的要求，血液质量不能按照现有标准进行判断。因此，需要建立针对高原储存血液的RBC质量评价指标，作为现行标准的补充。

现行血液质量评价标准通过检测储存期末溶血率、Hb含量、红细胞比容（hematocrit，HCT）和细胞存活率等指标对血液质量进行评价，本质上反映RBC结构的完整性。能量代谢在RBC结构改变过程中发生变化，因此通过检测RBC能量代谢可及时准确地反映血液的质量。成熟RBC 缺少细胞核和其他细胞器，糖酵解是RBC 产生ATP 获取能量的唯一途径，通过检测RBC的能量代谢可以全面准确地反映血液质量［8］。本实验室在前期研究中制定了细胞外流量（extracellular flow，XF）分析技术检测RBC 能量代谢的方案，并对海上储运血液RBC 的能量代谢进行了客观有效的评价［9］。该技术能在活细胞水平对血液进行高通量多指标动态检测，全面、直接、定量测定RBC 的代谢状态［10］。本研究以平原SRBC 和高原SRBC 为研究对象，利用XF 技术并结合国家血液质量评价标准综合判定RBC 质量［7，10-12］，探究高原环境储存对血液质量的影响。

1 材料与方法

1.1 血液、试剂和主要仪器

平原SRBC 是从长期居住在平原地区（北京）的健康人群采集血液并分离制备，由解放军总医院第五医学中心提供，共8 袋（每袋200 mL），用含腺嘌呤的柠檬酸-磷酸-葡萄糖溶液（citrate phosphate dextrose adenine-formula 1，CPDA-1）储存。高原SRBC 是从长期居住在高原地区（拉萨）健康人群中采集的血液中分离制备，由西藏军区总医院提供，共4 袋（每袋200 mL），亦用CPDA-1 储存。所有产品均经乙型肝炎病毒表面抗原、谷丙转氨酶、抗丙型肝炎病毒和抗人类免疫缺陷病毒抗体等初、复检测，检测结果合格。

CPDA-1储存液、葡萄糖、2-脱氧葡萄糖和游离Hb检测试剂盒（美国，Sigma公司），XF 基础培养基、XF 校准液和XF96 细胞培养板（美国，Seahorse Bioscience公司），细胞和组织黏合剂（美国，Corning公司），碳酸氢钠（北京化学试剂公司），无DNA酶和RNA酶水（天根生化科技有限公司）。

XF96 型细胞外流量分析仪（Seahorse Bioscience，美国），LH750型全自动血液分析仪（Beckman，美国），pH211 型pH 计（HANNA，意大利），MK3 型酶标仪、XY300 型电子天平和3111 型CO2恒温培养箱（Thermo，美国），3K15 型高速低温离心机（Sigma，美国），MiniSpin型小型台式离心机（Eppendorf，德国），SW-CJ-1FD 型超净工作台（北京冠鹏净化设备有限公司），BCD-190TMPK 型4℃冰箱（海尔公司）。

1.2 SRBC分组和处理

平原SRBC 分别置于3 个不同海拔地区血库（北京50 m，拉萨3650 m，林芝3100 m）4℃常规储存，分别储存35 和42 d，各取10 mL 用于检测。高原SRBC 置于拉萨地区血库4℃常规储存，分别储存35 和42 d，各取10 mL 进行检测。利用XF 技术检测RBC 胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR），根据公式计算基础糖酵解、葡萄糖反应性和糖酵解能力；结合储存期末溶血率、Hb含量、HCT 和细胞存活率血液质量评价指标，综合判定RBC质量。

1.3 邻甲联苯胺法检测游离Hb浓度

采用邻甲联苯胺法，利用Hb 中亚铁血红素在过氧化氢参与下能够催化邻甲联苯胺显色的原理检测游离Hb浓度，具体操作见参考文献［9］。游离Hb浓度（g·L-1）=（样品孔A400nm-空白孔A400nm）/（标准品孔A400nm-空白孔A400nm）×100 g·L-1，100 g·L-1为标准品（calibrator）的浓度。

1.4 全自动血液分析仪检测RBC、SRBC溶血率、总Hb浓度、HCT和细胞存活率

通过全自动血液分析仪进行RBC计数、总Hb浓度和HCT 检测，按仪器操作说明书进行。Hb 含量（200 mL SRBC）（g）=Hb（g·L-1）×200 mL，溶血率（%）=（1-HCT）× 游离Hb 浓度/总Hb 浓度×100%，细胞存活率（%）=储存后RBC 数量/储存前RBC 数量×100%。

1.5 XF分析技术检测红细胞能量代谢的变化

利用美国Seahorse Bioscience 公司的XF96型细胞外流量分析仪检测RBC 的ECAR 值，根据ECAR 值计算得到基础糖酵解、葡萄糖反应性和糖酵解能力3 个指标，具体操作见参考文献［9］。①基础糖酵解为加入葡萄糖前的ECAR 值，它代表在培养基中无葡萄糖时，RBC的极限呼吸水平；②葡萄糖反应性为加入葡萄糖后的ECAR 值减去加入葡萄糖前的ECAR 值，它代表RBC 对葡萄糖的吸收能力和细胞代谢的活力；③糖酵解能力为加入葡萄糖后的ECAR 值减去加入2-脱氧葡萄糖后的ECAR值，它代表RBC的能量代谢水平和能力。

1.6 统计学分析

实验结果数据以±s表示，应用GraphPad 软件进行两因素方差分析（two-way ANOVA）比较，组间两两比较用Tukey 法。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高原储存对平原SRBC溶血率、Hb含量、HCT和细胞存活率的影响

结果（图1）显示，高原拉萨储存的平原SRBC储存35 和42 d 储存期末溶血率（图1A）、HCT（图1B）、Hb 含量（图1C）和细胞存活率（图1D）变化与在北京储存的平原SRBC 相比均无统计学差异。高原林芝储存平原SRBC 35 d溶血率（图1A）升高（P＜0.05），但仍在《全血及成分血质量要求》规定的0.8%以内，其他指标无统计学差异；储存42 d储存期末溶血率（图1A）、HCT（图1B）、Hb含量（图1C）和细胞存活率（图1D）变化均无统计学差异。

Fig.1 Effect of plateau environment on hemolysis ratio（A），hematocrit（HCT，B），hemoglobin（Hb）content（C）and cell viability（D）of plain suspended red blood cells（SRBC）.Plain SRBC（from healthy people living in Beijing）was stored at three different altitudes（Beijing，Lhasa and Linzhi）for 0，35 and 42 d，respectively.Hb content（g）=Hb（g·L-1）×200 mL（SRBC）.±s，n=8.＊P＜0.05，compared with the group in Beijing at the same time.

2.2 高原储存对平原SRBC基础糖酵解、葡萄糖反应性和糖酵解能力的影响

高原拉萨储存平原SRBC 35 和42 d，基础糖酵解（图2A）、葡萄糖反应性（图2B）和糖酵解能力（图2C）变化与北京储存的平原SRBC 相比均无统计学差异。高原林芝储存平原SRBC 35 d 糖酵解能力降低（图2C）（P＜0.05），其他指标无统计学差异；42 d基础糖酵解（图2A）、葡萄糖反应性（图2B）和糖酵解能力（图2C）变化均无统计学差异。

Fig.2 Effect of plateau environment on baseline glycolysis（A），glucose response（B）and glycolysis capacity（C）of plain SRBC.See Fig.1 for the SRBC treatment.±s，n=8.＊P＜0.05，compared with the group in Beijing at the same time.

2.3 高原拉萨储存平原和高原SRBC溶血率、Hb含量、HCT和细胞存活率的比较

与高原拉萨储存高原SRBC 相比，高原拉萨储存平原SRBC 35和42 d，储存期末溶血率（图3A）、HCT（图3B）、Hb含量（图3C）和细胞存活率（图3D）变化均无统计学差异，且2 种SRBC 在储存35 和42 d溶血率均低于0.8%，符合血液质量安全标准。

2.4 高原拉萨储存平原和高原SRBC基础糖酵解、葡萄糖反应性和糖酵解能力的比较

与高原拉萨储存高原SRBC 相比，高原储存平原SRBC 35和42 d，基础糖酵解（图4A）、葡萄糖反应性（图4B）和糖酵解能力（图4C）变化均无统计学差异，说明高原拉萨地区储存对平原SRBC 的能量代谢无影响。

Fig.3 Comparison between plain SRBC and plateau SRBC in hemolysis ratio（A），HCT（B），Hb content（C）and cell viability（D）after stored in Lhasa.Plain SRBC and plateau SRBC（from healthy people living in Lhasa）were stored in Lhasa for 35 and 42 d，respectively.±s，n=4.

Fig.4 Comparison between plain SRBC and plateau SRBC in baseline glycolysis（A），glucose response（B）and glycolysis capacity（C）after storage in Lhasa.See Fig.3 for the SRBC treatment.±s，n=4.

3 讨论

输血是临床上治疗和抢救患者常用的重要手段，其中血液质量是输血治疗成功的关键。影响血液质量的因素有很多种，如温度及运输条件等。因此，在输血前需要对储存血液的质量进行检测和评估。本研究通过国家血液质量评价标准和XF分析技术从结构与能量代谢角度对高原地区储存的SRBC 质量进行评价，探究海拔高度是否影响保存SRBC 的质量。研究结果表明，在一定海拔范围内（0～3650 m），采用合适的保存液CPDA-1不影响保存SRBC的质量，SRBC可以得到很好的保存，平原SRBC在高原储存后可以使用。

首先观察不同海拔高度对平原SRBC 储存的影响。结果发现，与北京储存平原SRBC 相比，高原拉萨储存SRBC 35 和42 d，基础糖酵解、葡萄糖反应性和糖酵解能力指标未见明显异常，与国家血液质量评价标准指标检测结果一致。同时，高原林芝储存SRBC 42 d，上述能量代谢和血液质量指标未见明显异常。上述结果提示，海拔高度对平原SRBC储存质量无明显影响。本研究发现高原林芝储存SRBC 35 d的溶血率和糖酵解能力发生变化，这可能与本次样品从林芝到拉萨运输过程中的颠簸震荡有关。震荡产生的冲击力挤压RBC 膜，使RBC 变形甚至破裂溶血［13］。不过仅这1 个时间点的结果不影响对整体趋势的判断。

其次，为探讨高海拔环境能否作为血液保存的适合环境，即保存的血液能否在现行法规规定的储存期末（35或42 d）依然可用，本研究对高原拉萨储存的平原SRBC 和拉萨当地提供的高原SRBC 进行了比较，发现2种SRBC在保存35和42 d时能量代谢和血液质量指标均无显著性差异，且溶血率符合国家血液保存质量的标准，说明平原SRBC 在高原储存期内质量良好，可以使用。边巴琼达等［14］对世居高原地区人群和平原地区人群进行血常规分析，发现2组人群的白细胞计数、RBC计数、血小板和Hb等生理指标存在差异。他们采用的检测样品是抗凝外周血，为全血；本研究采用的检测样品为SRBC，是来源于全血的一种血液制品。根据国家标准《全血及成分血质量要求》（GB18469-2012），采用三联袋制备SRBC 的过程包括血液保存液稀释全血、离心去除血浆和添加CPDA-1保存液，经过制备过程消除了不同来源血液的差异，使它们在SRBC 水平基本一致。本研究结果表明，运送到高原的平原SRBC 和在高原采集的SRBC 在规定储存期内质量一致，为突发情况时平原SRBC 支援高原地区提供了理论支持。应注意的是由于本次研究样本量较少，还需加大样本量对此结果进行验证。

综上所述，本研究将XF 分析技术应用于高原特殊环境储存血液能量代谢评价，在活细胞水平对RBC 的能量代谢进行连续、动态的检测，并结合现有的血液质量评价标准对高原存储后的血液质量进行综合判断，为平原血液补给高原地区提供了理论支持，为完善高原环境下血液质量评价体系的建立提供参考。