加味四君子汤对脾气虚犬血清细胞因子水平、肠道免疫球蛋白水平以及脾脏组织形态及功能的影响

李成，贺濛初，舒迎霜，何嫣婷，冯士彬，李玉，王希春，吴金节

(安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036)

脾虚证是指因脾气血、脾阴或脾阳亏虚所呈现的一系列临床证候群的抽象归类[1]，中医理论认为脾主运化为后天之本，升清降浊，统摄血液，为气血生化之源，脾气虚弱则百病由生.脾虚证的现代研究起于20世纪70年代末的脾虚动物模型，至目前已涉及消化、代谢、神经、内分泌、免疫系统等方面[2-6].作为中医临床常见证候之一，脾虚证常以四君子汤为基础进行治疗.四君子汤是健脾益气基础方，出自《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓和炙甘草4味药组成，临床上多使用该方加减治疗脾虚证相关疾病.已有相关研究报道了加味四君子汤具有一定的抗癌和抗衰老的功效[7-8].加味四君子汤对脾虚证的作用本质目前仍无定论.本试验拟从免疫着手，采用番泻叶复制犬脾气虚模型，观察其血清细胞因子水平、肠道免疫球蛋白水平以及脾脏组织形态及功能的变化，并根据其泄泻、食少纳呆、神态萎靡等症状对四君子汤加味当归、黄芪、山楂、神曲等，观察加味四君子汤对脾气虚犬上述指标的作用效果，探讨加味四君子汤治疗脾气虚证的作用及其机制，以期为研究健脾益气的四君子汤加味方提供试验依据.

1 材料与方法

1.1 试验动物

1岁龄纯种‘比格犬’24只，由南京亚东试验动物研究中心提供.试验前进行常规免疫与驱虫，定量采食，自由饮水，隔离饲喂7 d.

1.2 主要仪器

TD-100小型提取浓缩机组(浙江森力机械科技有限公司)，MK3型半自动酶联免疫分析仪(美国Thermo公司)，CX31正置光学显微镜(日本OLYMPUS 公司)，YD-1508 R轮转式切片机(浙江金华益迪医疗设备厂)，HPX-9082MBE电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，DW-86L388A型-80℃冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)，JEM-1230型透射电镜(日本JEOL公司).

1.3 中药和试剂

番泻叶和加味四君子汤饮片(党参、茯苓、麸炒白术、甘草、当归、黄芪、山楂、神曲等)购于安徽合肥梅山路立方大药房；犬γ-干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒、白细胞介素2(IL-2)ELISA试剂盒、白细胞介素4(IL-4)ELISA试剂盒、白细胞介素6(IL-6)ELISA试剂盒和Tuftsin ELISA试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)；苏木素-伊红(醇溶)染液(Biosharp公司)；分泌型免疫球蛋白A(博奥森，bs-4964R)；UltraPure Agarose、SuperScript III RT反转录kit、Sybr qpcr mix(ABI-invitrogen公司)；酚氯仿、异丙醇、无水乙醇(无锡展望化工有限公司).

1.4 中药制备

番泻叶药液制备：准确称取5 kg番泻叶,筛选去除杂质，清洗，装入纱布袋连同清洗上清液投入TD-100小型浓缩机组提取罐中，加10倍量水，75 ℃提取2次，每次40 min，合并滤液，75 ℃浓缩成1 g/mL的药液，冷却后4 ℃保存.

加味四君子汤的制备：加味四君子汤由党参、茯苓、麸炒白术、甘草、当归、黄芪、山楂、神曲等按一定比例组方，清洗去除杂质后连同清洗上清投入提取罐中，加10倍量水，浸泡3 h，75 ℃提取2次，每次40 min，合并滤液，75 ℃浓缩成1 g/mL的药液，冷却后4 ℃保存.

1.5 试验犬分组处理

比格犬饲养1周后，取24只随机均分为4组，分别为对照组、脾气虚组、自然恢复组和加味四君子汤组.除对照组外其余各组试验犬只每天按体质量6 mL/kg剂量灌服番泻叶药液，分早晚2次灌服，直至出现符合脾气虚泄泻证的典型症状(泄泻严重、食少纳呆、神态萎靡、毛色枯燥、消瘦、易疲劳等[9])后，脾气虚组犬处死取样备用，对照组和自然恢复组犬饲喂基础日粮，加味四君子汤组犬在基础日粮中添加2%日粮重的加味四君子汤.试验期间，4组试验犬饲喂管理条件均一致，每日饲喂2次基础日粮，每次150 g.保证充足洁净饮水，犬舍每日打扫1次.常规消毒、免疫.

1.6 样本采集

1.6.1 采血与血清制备 分别于试验开始当天、造模成功后和治疗结束后从空腹犬前肢静脉采集非抗凝血，静置后3 000 r/min离心8 min，析出血清后分装于1.5 mL离心管，-20 ℃保存，用于检测血清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6水平.

1.6.2 脾脏及肠道组织样本的采集 试验犬称质量、麻醉后处死放血摘取脾脏，擦干称质量，用于计算脾脏指数，并取样分别置于液氮罐(用于检测Tuftsin水平)、4%多聚甲醛(用于HE染色)和2.5%戊二醛(用于电镜观察)中保存；取小肠各段(十二指肠、空肠、回肠)经生理盐水稍冲洗后分别分装于4%多聚甲醛(用于检测sIgA阳性表达水平)和液氮罐(用于检测IgA、IgG、IgM mRNA相对表达量)中保存，液氮罐中的样本随后转移至-80 ℃超低温冰箱保存.

1.7 指标检测与方法

1.7.1 试验犬血清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6水平 采用ELISA法检测，具体操作严格遵守ELISA试剂盒说明书，在MK3型半自动酶联免疫分析仪上测得D值后，再在Excel中根据标准品已知浓度和D值建立标准方程，计算样本浓度.

1.7.2 试验犬脾脏样本处理超低温冰箱中取出脾脏样本，研磨离心取上清，ELISA法检测组织中Tuftsin水平，具体操作严格遵守试剂盒说明书.取出4%多聚甲醛中的脾脏样本，常规石蜡包埋，切片，HE染色观察脾脏病理变化.脾脏样本在2.5%戊二醛固定一段时间后，冲去固定液，加入1%锇酸固定，经梯度酒精后环氧树脂包埋，切片，日产JEM-1230型透射电镜观察超微结构.

1.7.3 试验犬小肠样本处理取出4%多聚甲醛中的小肠样本，IHC检测小肠各段sIgA阳性表达水平，设置阴性对照，以PBS代替一抗、二抗.试验结束后使用Olympus显微镜Images图像分析系统对肠道免疫组化结果拍照，同一组织选择3个视野，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，对图片进行分析，结果以平均光密度(Density mean)表示.

依据GeneBank中犬IgA、IgG、IgM以及内参Actin的序列(GeneBank序列号为AY576788.1、EF207771.1、AF354265.1、NM_001195845.2)，使用Primer Primier 5.0软件设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1).Trizol试剂盒提取小肠各段RNA后，采用SuperScript III RT反转录kit进行反转录并合成cDNA，Sybr qpcr mix试剂盒进行荧光定量PCR试验，检测IgA、IgG、IgM mRNA相对表达量.

表1 PCR扩增用于的引物序列

1.8 数据处理

2 结果与分析

2.1 临床表征

试验开始当天记为第0 d，试验犬灌服番泻叶药液第2天出现粪便溏稀，随后出现食欲下降、毛色枯燥、消瘦以及怠倦乏力等症状，至第7天，有超过2/3的试验犬均表现出脾气虚症状，停止给药造模并于当天开始给药治疗，加味四君子汤组经治疗7 d后(试验第14天)，上述症状明显好转.

2.2 脾脏指数及脾脏Tuftsin水平的变化

造模后，脾气虚组犬与对照组犬相比脾脏指数及脾脏Tuftsin水平均显著降低(P<0.01).加味四君子汤治疗7 d后，加味四君子汤组犬脾脏指数及脾脏Tuftsin水平有所升高，与对照组相比无差异显著性(P>0.05)；自然恢复组犬脾脏指数及脾脏Tuftsin水平虽有升高但与对照组相比差异显著(P<0.05，P<0.01)，见表2.

表2 试验犬脾脏指数以及脾脏Tuftsin水平(n=6)

同列数据上标相同字母或者不标表示差异不显著(P>0.05)；上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；上标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

In the same column of the different groups,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05)；different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05)；different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).

2.3 血清中细胞因子水平的变化

造模后，与对照组相比，脾气虚组犬血清中IFN-γ、IL-2水平极显著降低(P<0.01)，IL-4、IL-6水平极显著升高(P<0.01).经加味四君子汤治疗7 d后(图1)，加味四君子汤组犬血清中IFN-γ、IL-2水平升高，IL-4、IL-6水平降低，与对照组相比无差异显著性(P>0.05)；自然恢复组犬血清中IFN-γ、IL-2水平略升高，IL-4、IL-6水平降低，与对照组相比差异显著(P<0.05).

2.4 脾脏病理变化

经解剖发现，脾气虚组犬脾脏较小，色泽暗，有固缩现象，触感硬有明显的凹凸感，甚至成蜷缩卷折状.

2.4.1 脾脏显微结构的变化由图2可见，对照组(A)犬脾脏在低倍镜下观察，形态结构较完整、清晰，白髓和红髓分界清楚，白髓由脾小体及动脉周围淋巴鞘组成，脾小体结构完整可见中央动脉.脾气虚组(B)犬与对照组(A)相比，脾脏结构不完整，红髓髓窦扩张、充血，白髓内淋巴细胞减少，脾小体萎缩.自然恢复组(C)犬可见脾脏结构有一定程度的恢复，红髓和白髓可以区分，白髓内淋巴细胞较脾气虚组增多，但脾小体结构较正常组不完整.经加味四君子汤治疗后，加味四君子汤组(D)犬的脾脏形态明显改善，红髓白髓分界清晰，可见小梁，白髓内淋巴细胞较自然恢复组(C)增多，可见中央动脉及动脉周围淋巴鞘；与对照组(A)相比基本恢复正常.

同一日龄不同处理组相比，图柱上标相同字母或者不标表示差异不显著(P>0.05)；上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；上标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).Among different groups in the same day age,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).图1 试验犬血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6含量Figure 1 The concents of IFN-γ，IL-2，IL-4 and IL-6 in the serum of the experimental canines

A：对照组；B：脾气虚组；C：自然恢复组；D：加味四君子汤组；△：红髓；↑：中央动脉；☆：脾小体；：动脉周围淋巴鞘；：髓窦；：脾索.A：Control Group；B：Spleen Deficiency Group；C：Natural Recovery Group；D：Supplementary SJZD Group；△：Red pulp；↑：Central artery；☆：Splenic nodule；：Periarterial lymphatic sheath；：Medullary sinus；：Splenic cord.图2 试验犬脾脏病理学变化(HE染色，×40)Figure 2 Pathological changes in the spleen of the experimental canines

2.4.2脾脏超微结构的变化经透射电镜观察各组犬脾脏细胞发现，对照组(A)细胞结构基本正常，胞间连接紧密，细胞器较完整，偶有空泡样变.脾气虚组(B)与对照组(A)相比明显可见核膜间隙增宽，核固缩，胞质内细胞器减少，线粒体脊排列紊乱、断裂以及线粒体空泡样病变.自然恢复组(C)核膜间隙相对脾气虚组(B)有所减小；与对照组(A)相比可见细胞器较少，细胞间缝隙增宽，线粒体脊断裂以及局部空泡化.加味四君子汤组(D)与对照组(A)相比无明显差异，但仍可见部分细胞存在修复痕迹(图3).

A：对照组；B：脾气虚组；C：自然恢复组；D：加味四君子汤组；→：示核膜间隙.A：Control group；B：Spleen deficiency group；C：Natural recovery group；D：Supplementary SJZD group；→：perinuclear space.图3 试验犬脾脏超微病理变化(×8 000)Figure 3 Ultrastructural pathological changes in the spleen of the experimental canines

2.5 小肠各段sIgA阳性表达水平的变化

IHC检测结果如图4所示，棕黄色区域为阳性表达产物，经苏木素复染，细胞核呈蓝色.试验犬小肠各段sIgA阳性表达产物主要分布于粘膜上皮及固有层小肠腺内部.图5反映了试验犬小肠各段sIgA阳性表达的平均光密度值.由图可知，试验犬小肠各段均有sIgA阳性表达产物，其中脾气虚组犬十二指肠sIgA阳性表达量极显著低于对照组犬(P<0.01)；自然恢复组犬十二指肠sIgA阳性表达量虽有升高但仍低于对照组犬(P<0.01)；经加味四君子汤治疗后，加味四君子汤组犬十二指肠sIgA阳性表达量明显恢复，与对照组相比差异不显著(P>0.05).试验犬空肠、回肠sIgA阳性表达量变化与十二指肠一致.

1：十二指肠；2：空肠；3：回肠；Y：阴性对照；A：对照组；B：脾气虚组；C：自然恢复组；D：加味四君子汤组.1：Duodenum；2：Jejunum；3：Ileum；Y.Negative control；A：Control group；B：Spleen deficiency group；C：Natural recovery group；D：Supplementary SJZD group.图4 试验犬小肠各段sIgA阳性表达水平(×400)Figure 4 The positive expression level of sIgA in the small intestine of the experimental canines

同一组织不同处理组相比，图柱上标相同字母或者不标表示差异不显著(P>0.05)；上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；上标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).Among different groups in the same tissue,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).图5 试验犬小肠各段sIgA平均光密度值Figure 5 The density mean of sIgA in the small intestine of the experimental canines

2.6 小肠组织中IgA、IgG、IgM mRNA相对表达量的变化

造模后，脾气虚组犬十二指肠IgA、IgG、IgM mRNA的相对表达量极显著低于对照组犬(P<0.01)；自然恢复组犬十二指肠IgA、IgG、IgM mRNA的相对表达量略有回升，但是仍然显著低于对照组犬(P<0.01)；经加味四君子汤治疗后，加味四君子汤组犬十二指肠IgA、IgG、IgM mRNA的相对表达量恢复至正常水平，与对照组相比差异不显著(P>0.05).空肠和回肠IgA、IgG、IgM mRNA相对表达量的变化，与十二指肠变化一致(图6).

3 讨论

本试验在中医基础理论指导下，选用番泻叶药液复制脾气虚证动物模型，试验犬表现的临床症状与中医脾气虚证候具有很多相似之处.粪便溏稀、食少纳呆，精神不振，毛发不荣，嗜卧不喜动等症状，符合中医脾气虚证候的特点，说明脾气虚模型复制成功.本试验中，脾气虚组犬多个免疫指标相比对照组均有下降，说明脾气虚证与机体免疫功能低下密切相关.

图6 试验犬小肠各段IgA、IgG、IgM mRNA的相对表达量Figure 6 The IgA，IgG and IgM mRNA realtive expression values in the small intestine of the experimental canines

3.1 加味四君子汤对脾气虚犬脾脏形态及功能的影响

脾脏作为机体最大的免疫器官，是具有免疫活性的T细胞和B细胞移居和接受抗原刺激产生免疫应答的重要场所，一般认为脾脏指数较高，说明机体免疫功能较强[10].脾脏主要由白髓、红髓以及边缘区构成，白髓是淋巴细胞主要聚集的场所；边缘区主要由吞噬细胞和B细胞组成，将白髓和红髓隔开，对抗原大小、类别起到筛选和屏障作用[11-12].Tuftsin是免疫球蛋白Ig G的Fc段在脾脏降解产生的一种内源性四肽，其分子量为500.59 ku，结构为苏-赖-脯-精氨酸(Thr-Lys-Pro-Arg,TKRP)[13-14].有研究表明Tuftsin生物活性较为广泛，在脾脏功能受损的情况下浓度降低，是反应脾脏免疫功能的特有因子[15-16].叶文斌等[17]用环磷酰胺建立免疫低下小鼠模型后发现，模型小鼠脾脏指数以及脾淋巴细胞增值明显降低；丁杨等[18]采用大黄灌胃复制脾虚小鼠后也发现脾淋巴细胞增值能力明显降低；廖乐乐等[19]研究发现，四君子汤可以使脾虚小鼠胸腺、脾脏萎缩现象得到改善，并修复胸腺、脾脏结构，促进T淋巴细胞增殖.本试验中，根据各组试验犬脾脏HE染色以及电镜观察结果均发现脾脏组织形态及淋巴细胞不同程度的改变，其中脾气虚组犬脾脏组织形态及淋巴细胞破坏程度较对照组明显，经加味四君子汤治疗后，可见明显修复；脾气虚组犬脾脏Tuftsin水平显著降低，经加味四君子汤治疗后，Tuftsin水平升高.结果提示，脾气虚犬脾脏组织形态发生改变并在一定程度上降低脾脏免疫机能，加味四君子汤可显著改善脾脏组织形态以及脾脏免疫机能低下的状态.

3.2 加味四君子汤对脾气虚犬血清细胞因子水平的影响

细胞因子是由活化的免疫细胞和非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有多种生物活性的小分子蛋白质.IL-2、IFN-γ主要由介导细胞免疫的Th1细胞产生；IL-4、IL-6主要由介导体液免疫的Th2细胞产生.Wang等[20]通过利血平复制大鼠脾气虚模型后发现其脾脏指数、内皮淋巴细胞上清液中IL-2、IFN-γ水平显著下降；金钟晔等[21]复制大鼠脾气虚模型后发现，其血清中IL-6水平较正常组显著升高；韩晓春等[22]复制大鼠水湿不化脾气虚模型后发现，其血清中IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4水平升高；杨冬花等[23]复制脾气虚大鼠模型并收集脾脏T淋巴细胞培养后发现，细胞上清中IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，Th0向Th2偏移，至Th1/Th2失衡，即“Th1/Th2漂移”现象；伍杨等[24]认为Th1优势状态具有免疫增强的作用.以上研究表明，脾气虚证的发生常伴随着细胞因子水平的变化，进而影响机体的免疫机能.辅助性T细胞在免疫反应中起着重要作用.本试验中，以Th1细胞分泌的IL-2、IFN-γ和Th2细胞分泌的IL-4、IL-6为研究对象，观察其水平的变化.脾气虚犬血清中IFN-γ、IL-2水平降低，IL-4、IL-6水平升高，表明Th0向Th2偏移，Th1/Th2失衡.经加味四君子汤治疗后，IFN-γ、IL-2水平回升，IL-4、IL-6水平降低，说明加味四君子汤可以有效的调节细胞因子水平，纠正漂移现象，提高机体免疫力.

3.3 加味四君子汤对脾气虚犬肠道免疫球蛋白的影响

肠道不仅是消化吸收的重要场所，同时也是机体防御外界病原入侵的重要免疫器官.肠粘膜作为机体防止感染的第一道防线，其屏障作用就显得尤为重要.戈娜等[25]认为，肠道免疫防御系统主要由存在于肠壁的肠相关淋巴样组织(GALT)及其分泌的免疫球蛋白A、G、M(IgA、IgG、IgM)等构成.分泌型免疫球蛋白A(sIgA)可由2个或2个以上的免疫球蛋白A(IgA)单体通过J链和分泌(SC)片以共价键形式结合而成，是粘膜免疫的主要效应因子[26]，其发挥主要作用的部位是局部粘膜，主要由粘膜固有层浆细胞产生.本试验中，我们采集了各组试验犬小肠各段(十二指肠、空肠和回肠)组织样本，并采用IHC法检测了小肠各段sIgA阳性表达量、RT-PCR检测了小肠各段IgA、IgG、IgM mRNA相对表达量.试验结果提示，脾气虚犬肠道粘膜的免疫机能低下，加味四君子汤可提高粘膜免疫球蛋白水平，有效改善脾气虚症状.

4 结论

综上所述，脾气虚证与机体免疫功能低下密切相关，加味四君子汤可显著增强脾气虚犬的免疫机能.表现在，添加加味四君子汤后脾气虚犬脾脏指数、脾脏Tuftsin水平显著升高，纠正了Th1/Th2细胞因子水平失衡，改善了脾脏组织及细胞病变，同时也提高了肠道免疫球蛋白表达水平.其治疗机制可能是加味四君子汤修复了受损的脾脏以及肠道粘膜，能够使其发挥免疫功能，从而提高机体免疫功能.