石氏逐痰通络补肾方对家兔膝骨性关节炎模型组织学变化的影响

吴军豪， 沈祉培， 闻国伟， 陈 巍（上海市黄浦区中心医院， 上海 200002）

膝骨性关节炎又称增生性膝关节炎、 膝骨关节病等，是骨科常见病之一， 由滑膜关节以伴有关节周围骨质增生为特点的软骨丧失所致[1］， 临床上以膝关节疼痛、 僵硬、活动受限等为特征， 可累及骨、 软骨、 滑膜、 关节周围支持结构。 随着人口老龄化加剧， 该疾病发生率呈逐年上升趋势， 传统上认为其机理是一个不可避免的渐发展退变性过程， 而膝关节滑膜炎性病变又促进骨关节炎病程进展。

研究显示[2］， 中医药对改善局部血液循环、 保护关节软骨、 防止关节软骨退变、 调节生物细胞因子促进软骨生长均有较显著的作用。 石氏逐痰通络补肾方由上海市黄浦区中心医院石氏伤科根据中医理论结合临床经验配伍组方，临床效果显著， 故本实验考察该方对家兔膝骨性关节炎模型关节软骨组织学变化的影响。

1 材料与方法

1.1 研究设计 采用随机平行对照方法， 在上海中医药大学附属曙光医院骨伤研究所进行实验， 光镜标本送往上海中医药大学光镜实验室读片。

1.2 动物 雄性6 月龄新西兰大白兔20 只， 体质量（2.3±0.4） kg， 由上海中医药大学动物实验中心提供。

1.3 分组 家兔喂养3 d， 称定质量后随机分为正常组、模型组、 逐痰通络补肾方组、 扶他林缓释片组， 每组5 只。

1.4 试药 逐痰通络补肾方（由生黄芪15 g、 牛蒡子9 g、僵蚕9 g、 制川草乌9 g、 土牛膝12 g、 威灵仙12 g、 仙灵脾12 g、 川断12 g、 泽漆9 g、 白芷9 g、 木瓜12 g、 乳香3 g、 没药3 g、 自然铜15 g、 豨莶草12 g 等药材组成）； 扶他林缓释片（瑞士诺华公司）。

1.5 造模 氯胺酮按0.1 g／kg 体质量的剂量肌注麻醉家兔后， Colombo 法建立膝骨关节炎模型[3］。

1.6 干预 术后第5 周起至第8 周结束， 逐痰通络补肾方组家兔每天给予0.09 g／kg 相应药物， 水煎浓缩后与饲料混合均匀， 制成定量颗粒饲料， 当天吃完； 扶他林缓释片组家兔每天给予0.09 g／kg 相应药物， 与饲料混合均匀， 制成定量颗粒饲料， 当天吃完， 以上给药量相当于临床等效剂量； 正常组、 模型组家兔未给药。

1.7 标本采集 各组家兔于9 周后空气栓塞处死， 打开右膝关节腔， 取下右膝关节标本， 在右股骨外髁取关节软骨。

1.8 指标检测

1.8.1 光镜 标本用10%福尔马林固定， 10%EDTA 脱钙，石蜡包埋、 切片， 厚度为5 μm， HE、 番红固绿染色， 每张切片选取5 个视野， 光镜下观察组织学变化情况， 并参照Colombo 的关节软骨病理积分标准[3］进行统计积分。

1.8.2 透射电镜 5% 戊二醛-4% 多聚甲醛固定， 10%EDTA 脱钙， 漂洗， 1%锇酸PBS 固定液固定， 乙醇逐级脱水， 环氧树脂618 包埋， 切片， 枸橼酸铅电子染色， 透射电镜下观察膝关节软骨细胞形态、 染色质、 细胞器、 胶原密度、 排列等。

1.9 统计学分析 通过SPSS 10.0 软件进行处理， 数据以±s） 表示， 组间比较采用非参数检验。 P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体情况观察 实验过程中， 正常组家兔未见明显异常； 第6 周， 模型组、 逐痰通络补肾方组、 扶他林缓释片组家兔膝关节明显肿胀， 部分有瘀紫， 关节活动度较差，不能正常行走； 第9 周， 逐痰通络补肾方组、 扶他林缓释片组家兔大部分膝关节肿胀程度低于模型组， 关节活动度优于模型组。 取出关节软骨进行观察， 发现正常组家兔关节软骨呈明亮蓝白色， 表面较软无裂纹； 模型组家兔关节软骨发黄无光泽， 表面较硬， 关节表面有裂纹； 逐痰通络补肾方组、 扶他林缓释片组家兔关节软骨微黄无光泽， 表面较软， 关节表面少量裂纹。

2.2 光镜观察 图1 显示， 正常组家兔软骨表面光滑， 软骨细胞散在、 均匀排列； 模型组家兔软骨层厚度明显变薄，软骨表面碎裂、 剥脱， 软骨层内排列稀疏、 不规则； 逐痰通络补肾方组、 扶他林缓释片组家兔关节软骨层厚度优于模型组， 软骨表面光滑， 而且前一组软骨层厚度更优， 排列也更致密整齐。

表1 显示， 逐痰通络补肾方组家兔关节软骨病理变化总积分显著低于模型组、 扶他林缓释片组（P＜0.05）， 同时扶他林缓释片组也显著低于模型组（P＜0.05）； 逐痰通络补肾方组家兔软骨细胞病理改变（细胞成簇和细胞缺失）、 软骨表层病理改变（表层缺损、 糜烂或溃疡， 表面脆裂）、 软骨深层病理改变（裂纹、 囊肿、 骨赘， 软骨下骨暴露） 均显著低于模型组、 扶他林缓释片组组（P＜0.05）， 同时扶他林缓释片组也显著低于模型组（P＜0.05）。

图1 各组家兔膝骨性关节炎模型HE 染色（×100）

表1 各组家兔关节软骨病理变化积分比较， n=25）

表1 各组家兔关节软骨病理变化积分比较， n=25）

注：与模型组比较，∗P＜0.05；与扶他林缓释片组比较，#P＜0.05

软骨细胞 0.85±1.00 6.55±0.95 3.15±1.08∗# 4.05±0.82∗软骨表层 1.05±0.85 7.05±1.28 4.05±0.92∗# 5.45±1.12∗软骨深层 1.15±0.82 10.50±0.72 5.40±1.22∗# 8.05±1.05∗总积分 3.05±1.52 24.10±1.40 12.60±1.55∗# 17.55±1.40∗

图2 显示， 正常组家兔透明软骨层呈深红色， 软骨细胞散在、 均匀排列； 模型组家兔透明软骨厚度明显变薄，而且其中部分因纤维化显示绿色； 逐痰通络补肾方组、 扶他林缓释片组家兔透明软骨厚度优于模型组， 绿色纤维化组织少， 而且前一组透明软骨厚度更优， 纤维化程度也更低。

2.3 电镜观察 图3 显示， 正常组家兔软骨细胞大小均匀， 细胞膜完整， 细胞结构清晰， 染色质分布均匀， 细胞周围存在大量胶原纤维； 模型组家兔软骨细胞大小不一，大量细胞膜被破坏， 细胞结构不完整， 细胞核出现固缩，表明细胞可能发生坏死或者凋亡， 同时细胞周围胶原纤维减少、 排列不整； 逐痰通络补肾方组家兔核膜、 细胞结构完整， 核内染色质分布均匀， 细胞周围胶原纤维排列整齐；扶他林缓释片组家兔软骨细胞膜和细胞结构有所修复， 但不如逐痰通络补肾方组明显， 同时部分软骨细胞核仁变性。

3 讨论

最新流行病学调查[4］显示， 60 岁以上人群中膝骨性关节炎患病率可达50%， 75 岁以上人群中则达80%， 软骨退变与损坏与其发病密切相关[5］。 目前， 该疾病治疗手段主要包括氨基硫酸盐、 镇痛剂、 非甾体类消炎药（NSAID）、透明质酸衍生物、 皮质醇类关节腔内给药， 关节镜手术、关节置换等[6］， 但各自都存在缺陷， 临床上尚缺乏特效方法。

图2 各组家兔膝骨性关节炎模型番红固绿染色（×100）

膝骨性关节炎属中医“骨痹” “痛痹” “寒痹” “鹤膝风” 范畴， 《张氏医通》 曰： “膝为筋之府， ……膝痛无有不因肝肾虚者， 虚则风寒湿袭之”， 而且患者中以肾阳虚、瘀阻脉络2 种症候最多[7］。 近年来相关研究表明， 中医药可从关节软骨细胞、 软骨内胶原纤维、 软骨滑膜等多个方面改善关节软骨组织的病理变化[8］， 通过抑制细胞因子释放来减轻软骨炎症反应和损伤[9］， 还能降低关节内氧自由基含有量， 防止软骨基质降解[10］。

图3 各组家兔膝骨性关节炎模型电镜图（×5 000）

石氏认为， “痰夹瘀血碍气而病” 是膝骨性关节炎发病的主要原因， 一旦损伤必有气机受阻， 气机不畅必然影响到血的运行， 凝滞成瘀， 而血瘀又可使气运失畅， 促成痰的形成[11］， 同时还指出“……损伤气血自属气脉闭塞，脘窍凝滞之类， 易于痰聚为患”， 故痰的凝聚能影响气机正常运行， 气机阻滞， 运行不畅， 则血运失畅， 从而促成血瘀的形成， 反之损伤血瘀也能使气机运行失常， 气结则痰生内聚[11］， 因此石氏治疗该疾病时以“痰瘀相关” 理论为指导， 通过逐痰通络补肾方随症出入， 用于逐痰活血，通络补肾， 改善循环， 抑制炎症介质， 保护及修复关节软骨。 石氏逐痰通络补肾方中黄芪甘温， 补气兼能行滞通痹，助以川草乌宣通血脉、 散寒除湿； 牛蒡子辛寒滑利， 豁痰消肿， 白僵蚕消痰散结和气血， 二药合用宣滞破结， 能化筋络顽痰独邪， 助以泽漆行水化湿消肿； 佐以乳香、 没药通气活血， 白芷、 白蒺藜祛风散寒， 木瓜、 桑枝、 土牛膝等诸药祛风湿、 舒筋络、 利关节、 强筋骨， 全方围绕“痰” “瘀” 二邪， 兼顾气血， 体现了石氏伤科的经典用药思想——气血行， 痰瘀祛， 而筋骨自健。

本实验对家兔膝骨性关节炎模型进行组织学变化观察，发现石氏逐痰通络补肾方具有修复损伤软骨层与透明软骨、阻止软骨纤维化、 保持及恢复软骨细胞结构完整性等作用，而且效果优于扶他林缓释片， 可为该方相关治疗提供确切依据。