正交实验优化酶解预处理提取银杏叶黄酮和内酯的工艺

冯自立，赵正栋，孙茜，朱志斌，李颖，任晓峰

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 维生素D生理与应用研究所，陕西 汉中 723000； 3.汉中市植物提取产业研发中心，陕西 汉中 723000)

银杏(GinkgobilobaL.)为银杏科银杏属落叶乔木，为我国特产植物[1]。银杏叶为银杏的重要药用部位，其主要有效成分为黄酮类和内酯类化合物[2]。银杏黄酮具有抗衰老、抗肿瘤、抗菌、消炎等功效[3-5]，银杏内酯对改善脑缺血、扩张冠状动脉血管、增强心肌收缩力和保护神经中枢效果显著。银杏叶提取物药理活性广泛且不良反应较少[6]，被广泛的应用到药品和功能食品领域。

目前，银杏叶提取物生产工艺主要有有机溶剂提取、微波提取、超临界流体萃取、超声提取以及酶解提取等[7-9]。银杏叶中黄酮和内酯类化合物主要存在于细胞壁内，传统方法提取效率较低。采用酶解的方法对银杏叶粉进行预处理，可有效破坏银杏叶细胞壁，使其中有效成分银杏黄酮和银杏内酯更好的溶出[10-12]。为生产高质量银杏叶提取物提供数据参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

银杏叶(2016年8月采摘自陕西省宁强县，6年龄树，60 ℃烘干、粉碎后过40目筛)，总黄酮含量8.8 mg/g，总内酯含量3.7 mg/g；纤维素酶(5×104U/g)、果胶酶(3×104U/g)、复合酶(纤维素酶∶果胶酶=1∶1)均为食品级；槲皮素、山奈酚、异鼠李素、银杏内酯A、B、C和白果内酯对照品；乙醇、盐酸、乙酸乙酯、醋酸钠均为分析纯；正丙醇、磷酸、四氢呋喃、甲醇均为色谱纯；LX-5大孔吸附树脂，工业级；超纯水，自制。

JA 2603B电子天平；JB 90-D电动强力搅拌器；SY21-K恒温水浴锅；N-1200B旋转蒸发仪；SHZ-D循环水真空泵；BS50-1A双通道恒流泵；7D5A-WS离心机；Thermo UltiMate 3000高效液相色谱仪(HPLC-UV)；Agilent 1260高效液相色谱仪；串联UM5000蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品酶解预处理 称取干燥银杏叶粉末50.0 g，放入1 L三口烧瓶，加入质量1/300的酶粉，加水200 mL，进行机械搅拌，用0.1 mol/L的盐酸调节pH值，在温度50 ℃酶解4 h。

1.2.2 黄酮和内酯提取 酶解结束后，加乙醇水溶液，调整体系乙醇浓度为20%，料液比为1∶10 g/mL，回流提取2次，每次2 h，合并提取液，过滤,浓缩至无醇味后，上LX-5大孔吸附树脂柱进行纯化，10%乙醇溶液除杂，70%乙醇水溶液洗脱，浓缩、干燥、粉碎后，得银杏叶提取物。分别用HPLC-UV和HPLC-ELSD法检测总黄酮和总内酯含量。

1.3 黄酮和内酯含量测定

1.3.1 对照品溶液制备

1.3.1.1 总黄酮对照品溶液制备 精密称取槲皮素、山奈酚和异鼠李素对照品各6.0 mg，定容至5 mL，制成银杏黄酮混合对照品母液。再将该母液分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍，摇匀、过滤，即得。

1.3.1.2 总内酯对照品溶液制备 精密称取白果内酯和银杏内酯A、B、C各8.0 mg，定容至5 mL,制成银杏内酯混合对照品母液。再将该母液分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍，摇匀、过滤，即得。

1.3.2 供试品溶液制备[13]

1.3.2.1 银杏黄酮供试品溶液制备 精密称取酶解法制备的银杏叶提取物35.0 mg，加25 mL甲醇-25%盐酸(4∶1)的混合溶液，加热回流0.5 h，冷却至室温，定容至50 mL，摇匀、过滤、取续滤液即得。

1.3.2.2 银杏内酯供试品溶液制备 精密称取酶解法制备的银杏叶提取物150.0 mg，加水10 mL，50 ℃超声10 min,使样品充分溶散。滴加2.0%盐酸0.5 mL，用乙酸乙酯萃取4次，每次10 mL，合并萃取液。用20 mL 5%的醋酸钠洗涤，醋酸钠溶液用10 mL乙酸乙酯洗涤。合并乙酸乙酯萃取液及洗涤液，用40 mL水分2次洗涤，水液合并用10 mL乙酸乙酯洗涤，合并乙酸乙酯提取液及洗液，减压蒸干，残渣用甲醇溶解，并定容至5 mL，摇匀，过滤，取续滤液即得。

1.3.3 色谱条件

1.3.3.1 银杏黄酮检测色谱条件 高效液相色谱仪，AcclaimTM120 C185 μm，4.6 mm×250 mm色谱柱，柱温25 ℃，流动相为甲醇∶0.4%磷酸溶液(50∶50)，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。

1.3.3.2 银杏内酯检测色谱条件 高效液相色谱仪串联UM5000蒸发光散射检测器，AcclaimTM120 C185 μm，4.6 mm×250 mm色谱柱，流动相为正丙醇∶四氢呋喃∶水=1∶15∶84，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温35 ℃，载气为氮气，流速2.5 L/min，飘移管温度90 ℃。

1.4 数据处理

利用统计分析软件Design-Expert 8.05对实验结果进行统计分析，按照公式(1)和公式(2)计算黄酮提取率(X)和内酯提取率(Y)。

(1)

(2)

2 结果与讨论

2.1 正交实验结果

根据课题组前期做的银杏叶酶解单因素实验以及相关文献报道[9-12]，选取酶用量、酶解时间、酶解温度、酶解pH值4个因素，各取3个水平，采用L9(34)正交表进行酶解实验，以银杏总黄酮和银杏总内酯提取率为指标，同时以两者的最大数值为参考，进行数据归一，得出权重系数。将银杏总黄酮提取率的权重系数设为0.5，银杏总内酯的权重系数也设为0.5，进行统计分析。综合评分M=0.5X×100/94.24+0.5Y×100/93.35。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平表

由表3可知，因素A和C对实验结果具有显著影响(0.01>P>0.05)，因素B对实验结果具有一定的影响(0.05>P>0.10)，其影响顺序为酶用量(A)> 酶解温度(C) >酶解时间(B)>酶解pH值(D)，银杏叶酶解最佳工艺组合为A2B3C2D2，即酶用量为银杏叶的1/300，酶解时间4.0 h，酶解温度50 ℃，酶解pH值为5.0。

表2 正交实验结果

表3 方差分析

注：F0.10(2,2)=9.00，F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00。

2.2 酶解验证实验

按照优选工艺组合，取银杏叶粉末3份，每份50.0 g，加酶0.17 g，加水200 mL搅拌均匀后，用0.1 mol/L盐酸调节酶解液pH=5.0，于50 ℃酶解4.0 h。

结果银杏黄酮平均提取率为92.38%，RSD(n=3)为1.18%，银杏内酯平均提取率为91.74%，RSD(n=3)为1.47%，表明该工艺重复性好，稳定可靠。

提取物中黄酮含量最高可达30.32%，总内酯含量最高可达8.85%，比商务部《国际商务标准 植物提取物银杏叶提取物 SW/T 1—2013》和《2015版中国药典 银杏叶提取物》所规定的黄酮24.0%、内酯6.0%分别高出6.32和2.85个百分点。

3 结论

银杏叶酶解预处理最佳工艺为：酶用量为银杏叶的1/300，酶解4.0 h，酶解温度50 ℃，酶解pH值为5.0。银杏黄酮平均提取率为92.38%，RSD(n=3)为1.18%，银杏内酯平均提取率为91.74%，RSD(n=3)为1.47%，工艺重复性好，稳定性高。提取物中总黄酮含量最高可达30.32%，总内酯含量最高可达8.85%，比商务部《国际商务标准 植物提取物银杏叶提取物 SW/T 1—2013》和《2015版中国药典 银杏叶提取物》所规定的黄酮24.0%、内酯6.0%分别高出6.32和2.85个百分点。该工艺的研究为酶法预处理制备高规格银杏叶提取物的工业化生产奠定了基础，可以有效降低生产工艺成本，促进国内银杏叶提取物产品产量和质量的提升。