miRNA-145、VEGF与川崎病患儿冠脉损伤关系的初步研究

顾 勇 窦常胜 邰海服

皖南医学院弋矶山医院儿科，安徽省芜湖市 241001

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一种好发于年幼儿童的血管炎性病患[1-2]，可累及全身多处器官，以心血管后遗症为严重，容易并发冠状动脉损伤(Coronary artery lesion，CAL)，阐明KD冠状动脉损伤发病机制必将为其治疗提供理论依据。有研究表明[3]，KD患儿血清中的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表达水平可出现明显升高，且与KD患儿CAL相关，但其具体调控机制尚不清楚。在对成年人冠心病患者冠脉损伤机制的研究发现[4-5]，VEGF是miRNA-145的靶基因，冠心病患者血浆miRNA-145表达明显降低，且VEGF表达水平与miRNA-145呈负相关，推测VEGF可能受miRNA-145的调控参与了冠脉损伤。但在川崎病中有关二者的表达变化及与KD冠脉损伤的关系，目前国内外尚未见相关报道。本研究拟通过观察川崎病患儿冠脉损伤组及非冠脉损伤组miRNA-145和VEGF表达变化及二者相关关系，初步探讨KD患儿冠脉损伤的可能调控机制。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2017年1月—2018年6月在我院儿科确诊为急性期川崎病的27例患儿作为观察组，患儿入组后立刻进行超声心动图检查，依据是否合并冠状动脉损伤，将患儿分为冠脉损伤组(CAL组)12例和非冠脉损伤组(NCAL组)15例。纳入标准：所有入组患儿均符合日本川崎病委员会2005年第四次修订的诊断标准[6]，同时参照美国多学科委员会制定的最新川崎病诊断流程。随机选取同一时间段在我院儿童保健门诊进行健康体检的正常健康儿童18例作为对照组，均经严格筛查排除器质性疾病。对照组与观察组相比在年龄、性别上差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集：收集患儿外周血标本，且所有收集的血标本均在大剂量IVIG静脉注射治疗前进行采集。同期收集健康对照组18例儿童外周血标本。所有收集的血液标本加入EDTA抗凝，经3 000r/min离心5min，收集上清液，分装冻存于-80℃冰箱备用。

1.2.2 miRNA测定：取上述血浆样本300μl，采用Trizol(GibcoBRL公司)和miRNeasy Mini Kit(美国Qiagen公司)按试剂盒说明书提供的方法进行RNA的提取和纯化，提取RNA所用的一次性塑料器具均经过DEPC水处理。血浆中miRNA-145的表达采用RT-PCR方法测定。取待测样本总RNA400ng，利用Taqman miRNA转录试剂盒合成cDNA，miRNA特异性茎环结构(stem-loop)逆转录引物(美国Applied BioSystems公司)进行miRNA逆转录，利用美国ABI 7500 Fast RT-PCR仪检测血浆中miRNA-145的表达，反应体系和程序设置均参照RT-PCR试剂盒说明书进行。所有反应均进行3次平行操作，取平均值。

1.2.3 血浆中VEGF 水平的测定：ELISA法检测血浆中VEGF (VEGF试剂盒，Abcam公司)，操作步骤参考说明书，记录450nm处待测样品的OD值。每个样品均设置3个复孔，取平均值，用于绘制标准曲线和计算待测样品水平。

2 结果

2.1 三组VEGF、 miRNA-145比较 RT-PCR结果提示，三组之间miRNA-145差异均有统计学意义(F=64.53，P<0.01)，CAL组患儿相对表达量低于NCAL组及对照组，NCAL组介于两组之间，差异具有统计学意义；ELISA法提示 三组之间VEGF差异均有统计学意义(F=52.87，P<0.01)，其中CAL组患儿表达量明显高于NCAL组与对照组，NCAL组介于两组之间，差异有统计学意义。见表1。

2.2 miRNA-145与VEGF相关性分析 KD患儿冠脉损伤组血浆VEGF随miRNA-145表达上调而降低，二者呈明显的负相关关系(r=-0.707，P<0.01)。见图1。

表1 KD患儿及健康对照组血浆VEGF及miRNA表达水平

注：字母a、b、c代表三组之间均存在统计差异(P<0.01)。

图1 miRNA-145和VEGF相关分析

3 讨论

川崎病目前病因不是十分明确，多数学者认为本病为一种全身性出疹性血管炎症病变，CAL是KD常见的并发症，严重病儿在病程进展过程中可出现心肌梗死，甚至猝死，目前普遍认为CAL可能是成年以后冠心病的重要危险因素之一[7]。因此，阐明KD发生CAL的发生机制，无疑将为其治疗提供重要的理论依据。

研究发现[8]，miRNA广泛分布于心脏及血管系统，并且同时参与原始心管的胚胎发育，可以来调节心肌细胞、血管内皮细胞的生理病理变化过程。miRNA参与心肌和血管平滑肌细胞的信号传导，并与成年冠状动脉粥样硬化、心律失常、心肌炎症和血管增生等许多疾病的病理生理有关。目前已有研究表明[9]，miRNA在KD的发生发展中也发挥着一定的调节作用，但miRNA与KD冠脉损伤的关系目前国内外鲜有报道。有研究表明[10-11]，miRNA-145与机体的血管生成的过程相关, 其大量表达于小、中动脉血管壁的平滑肌细胞中，通过调节血管平滑肌细胞功能进而影响下游因子，推测其可能参与心脏及血管系统相关病患的发生发展过程。而VEGF则是一种具有高度保守性的促血管内皮细胞生长因子，其功能上可促进中小血管通透性增加、各种细胞外液基质变性，以及促进中小血管内皮细胞变移、增生和微血管再生形成等作用。有研究表明[12]，在冠心病患者血浆中，VEGF表达增高，miRNA-145表达明显下调，并且VEGF与miRNA-145表达呈负相关，miRNA-145可通过影响其下游靶基因相关因子VEGF的表达，来调控血管形成和再生，从而参与了冠脉病变发生机制。对成人血管形成机制的进一步研究发现[13-14]，VEGF是miRNA-145的靶基因，miRNA-145可以通过抑制VEGF的表达参与血管的新生及血管平滑肌细胞表型的变移。

已有研究表明[15-16]，在KD患儿急性期, VEGF表达水平出现增高；同时伴有CAL的KD患儿，VEGF水平增高的更加明显，提示其不仅可能参与了KD的发病过程, 而且与CAL的严重程度有关。但目前miRNA-145参与KD冠脉损伤的研究，国内外尚未见相关报道。探讨miRNA-145、VEGF与KD冠脉损伤的相关性，有助于进一步揭示KD其形成机制，并为其治疗提供理论依据。为此，本研究选择与多种心血管疾病的发生及发展密切相关的miRNA-145和VEGF，测定其在KD急性期CAL组及NCAL组的表达水平及两者之间的关系，探讨两者是否参与KD冠脉损伤及其可能机制。本研究发现，miRNA-145在CAL组、NCAL组及正常对照组之间差异均有统计学意义(P<0.01)，CAL组患儿相对表达量低于NCAL组及对照组，NCAL组介于两组之间，差异具有统计学意义；ELLISA法提示VEGF同样也在三组之间差异有统计学意义(P<0.01)，其中CAL组患儿表达量明显高于NCAL组与对照组，NCAL组介于两组之间，差异有统计学意义。说明miRNA-145和VEGF参与了KD的发病机制，且与冠脉损伤相关。相关分析发现，miRNA-145和VEGF表达呈明显负相关系，推测miRNA-145可能通过调节VEGF的表达参与KD的发病机制。综上，miRNA-145和VEGF可作为川崎病辅助诊断指标，但由于本研究样本量小，有一定的局限性，KD冠脉损伤的确切机制尚有待于进一步研究。