高迁移率族蛋白B1对人牙周膜干细胞增殖、分化影响的体外研究

徐贤寅 朱金晓 朱文婷 李晓丹

江苏省无锡市儿童医院口腔科 214023

高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1) 是一种具有高度保守性的DNA 结合蛋白，它在许多种细胞内均有表达，对细胞核的稳定、DNA转录、复制等功能具有重要的调控作用[1]。近年研究发现，HMGB1在特定的情况下，能被主动或被动地释放到细胞外，具有类似于炎症因子的作用，发生一系列生物学反应。人体的牙周组织具有极强的自我修复能力,这种能力来源于牙周膜内的一种未分化间充质细胞，其具有干细胞的特性，能自我更新并多向分化，故被称之为牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)[2-3]。一般情况下，牙周膜干细胞处于静息状态，以维持牙周膜的稳定状态。当受到外界刺激时其随之发生一系列反应，导致牙周组织的改变。笔者通过体外细胞实验，观察HMGB1对人牙周膜干细胞生物反应的影响，探讨HMGB1在人牙周组织反应中的作用，以期为临床上牙周炎的控制找到一个新的靶点。

1 材料与试剂

(1)主要试剂：高迁移率族蛋白B1 (R&D 公司,美国)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；引物由上海吉玛公司合成；DMEM 培养基(Gibco公司，美国)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠(Sigma公司,美国)；Ⅰ型胶原酶(Gibco公司，美国)。(2)主要材料：人牙周膜干细胞通过酶解组织法获得并采用有限稀释克隆法纯化。

2 方法

2.1 人牙周膜干细胞的分离与培养 收集临床上健康青年(20～25岁)拔除的牙周健康、无龋的新鲜第三磨牙，放无菌台上，液漂洗3～5次，刮下根中1/3牙周膜，在含有2mg/mlⅠ型胶原酶的溶液中消化30min，离心后去上清，移入25ml培养瓶，加入完全培养液，于37℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱中孵育。3d后开始每2～3d更换培养液1次，7～10d把组织去掉，收获人牙周膜干细胞。取处于对数生长期的细胞的培养上清液，离心、过滤后，与培养基以1∶1比例混合培养，融合达到80%，用胰蛋白酶消化，作传代培养细胞。取对数生长期的第1代细胞，调整细胞密度至5 000个/cm2，接种于96孔培养板中(1 500个/cm2细胞)。5d后换液，光镜下观察克隆形成情况。常规培养7～14d，至出现细胞克隆(细胞数≥50为判定标准)，待克隆长至孔底1/3～1/2后胰酶消化，转移至24孔板扩大培养。

2.2 MTT实验检测HMGB1对人牙周膜干细胞增殖的影响 取培养的第三代人牙周膜干细胞，接种于96 孔细胞培养板中，在细胞培养箱内孵育24h。分成3组，两组中分别更换含有100ng/ml和200ng/ml HMGB1的培养液，另一组作为空白对照。经HMGB1诱导培养后，分别在第1、3、5天取出1块培养板，用MTT检测试剂盒分析人牙周膜干细胞的增殖能力。操作参考试剂盒说明书。

2.3 RT-PCR法检测人牙周膜干细胞中相关基因表达 取培养的第三代人牙周膜干细胞，接种于6 孔细胞培养板中，孵育24h。分成3组，两组中分别更换含有100ng/ml和200ng/ml HMGB1的培养液，隔天换液，保证HMGB1浓度，另一组作为空白对照。经HMGB1诱导7d后，采用Trizol一步法提取细胞总RNA，20μl体系反转录1 000ng RNA，进行相关基因的RT-PCR反应：增殖细胞核抗原(PCNA)、白细胞介素-1b(IL-1b)、 肿瘤坏死因子α(TNFα)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)，各引物序列见表1。

表1 PCNA、IL-1b、TNFα和TRAP的引物序列

2.4 统计学方法 所有数据采用统计分析软件SPSS21进行处理，各组数据间进行比较分析，P<0.05显示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 HMGB1对人牙周膜干细胞增殖的影响 经100ng/ml和200ng/ml的HMGB1诱导人牙周膜干细胞后，第3天和第5天经MTT检测结果显示，两实验组较对照组的OD值有明显升高(P<0.05)(图1)，实验组间比较OD值差异无统计学意义(P>0.05)，说明HMGB1对hPDLSCs有促进增殖作用。经100ng/ml HMGB1诱导7d后，镜检显示人牙周膜干细胞数量明显增多，细胞增殖活跃，见图2。

图1 不同浓度HMGB1诱导对人牙周膜干细胞的增殖作用

图2 100ng/ml HMGB1诱导对人牙周膜干细胞的增殖作用

注：A.诱导前，B.诱导7d后。

3.2 HMGB1对人牙周膜干细胞中PCNA、IL-1b、TNFα和TRAP基因表达的影响 两种浓度的HMGB1(100和200ng/ml)诱导人牙周膜干细胞后，在第7天采用RT-PCR检测发现两实验组较对照组中PCNA表达明显增加(P<0.05)(图3)，提示100和200ng/ml的HMGB1诱导使hPDLSCs的具有旺盛的增殖活性；同样IL-1b、TNFα和TRAP的表达均明显增加(P<0.05)，见图4～6，说明100和200ng/ml的HMGB1诱导对hPDLSCs的破骨作用有明显提高。

4 讨论

与组蛋白类似，高迁移率族蛋白也是最重要的染色质蛋白之一。在细胞核中，HMGB1与核小体、转录因子和组蛋白相互作用，调控DNA转录。HMGB1在许多转录因子的相互作用中支持多种基因的转录，参与细胞复制、分化等重要生命活动。HMGB1存在于细胞核中的但当赖氨酸残基上的过乙酰化可使它转位到细胞质中。1999年，Wang等[4]发现HMGB1可以被释放到胞外，局部出现类似于炎症因子介导炎症反应。随后，HMGB1作为一种炎症介质或促炎细胞因子逐步进入人们的视线，有研究表明HMGB1参与人体多种疾病的发展，如自身免疫性疾病，肺炎、糖尿病、肿瘤等[5-6]。

随着对HMGB1的深入研究，HMGB1在牙周组织中的反应情况进入了口腔科医生的视线。牙周炎是口腔内最常见的疾病之一，主要表现为牙周组织的慢性炎症。通过对龈沟液成分的研究发现，作为一种外泌性炎症介质，HMGB1在牙周炎患者的龈沟液的含量明显增加，而健康人的龈沟液中则没有变化[7]。笔者在前期的临床研究中发现，龈沟液HMGB1 含量与牙槽骨吸收呈正相关性。成纤维细胞是牙周膜中最主要的细胞，参与牙周组织的一系列生理反应。孙钦峰等[8]通过对牙周膜成纤维细胞的研究发现，HMGB1能影响其细胞表面白细胞介素-6(IL-6)、破骨细胞核因子κB受体活化因子(RANKL)、骨保护因子(OPG)的表达，改变RANKL/OPG比值。

图3不同浓度HMGB1诱导人牙周膜干细胞中PCNA的表达 图4 不同浓度HMGB1诱导人牙周膜干细胞中IL-1b值不同 图5不同浓度HMGB1诱导人牙周膜干细胞中TNFα的表达 图6 不同浓度HMGB1诱导人牙周膜干细胞中TRAP的表达

牙周膜干细胞作为成体干细胞中较年轻的一员,于2004年首次由Seo 等[9]获得，它平时在牙周膜组织处于静息状态,维持牙周组织稳态,当局部因素导致牙周膜损伤时，这些干细胞能增殖、分化，促进牙周组织修复、再生。本实验中MTT检测结果显示，人牙周膜干细胞在HMGB1的诱导下，在第3天、第5天已经表现出明显的增殖反应，提示牙周组织在炎症情况下，HMGB1能引起人牙周膜干细胞增殖。细胞因子PCNA是一种位于细胞核内的DNA聚合酶δ的辅助蛋白，其变化情况与DNA的合成有关[10]。本实验中人牙周膜干细胞经HMGB1诱导后，第7天RT-PCR检测结果发现PCNA表达明显增加，进一步证实hPDLSCs处于旺盛的增殖状态。

IL-1是一种多功能细胞因子，在牙周组织中能通过介导一系列炎症反应，进而导致牙槽骨吸收和胶原降解，促进牙周炎进一步发生，最终导致牙齿松动、脱落[11]。TNF是一种内源性炎症细胞因子，与感染性疾病密切相关。通过对牙周炎患者的检查发现，在其牙周组织中以及龈沟液中检测到大量的TNF，其含量的高低与牙周炎的活跃程度相关，其含量越高牙周组织的破坏程度越严重[12]。TRAP是破骨细胞的特征性酶，TRAP参与骨基质中固体钙磷矿化底物的降解，其表达和分泌与破骨细胞功能密切关系，调控TRAP的表达促进破骨过程，减少成骨[13]。本实验结果显示，人牙周膜干细胞经HMGB1诱导后，第7天IL-1、TNF表达明显增加，说明其能促进炎症反应；TRAP表达的明显增加，提示细胞的破骨功能得到加强。

本次实验的结果显示，人牙周膜干细胞能被HMGB1刺激发生增殖，使得局部炎症反应放大，同时破骨作用也得到了加强。这一实验结果提示：HMGB1在牙周组织的破坏中起到重要作用。如何利用HMGB1作为靶点进行牙周炎症控制，同时促进牙周组织修复再生，需要在今后的工作中进行更深入的研究。