基于CUMS大鼠逍遥散拆方药队抗抑郁作用的BDNF通路分子机制研究

贺欣雨，王学，石博宇，罗杰，刘小波，彭希，曾南，刘蓉

逍遥散源于《太平惠民和剂局方》，具有调和肝脾、养血健脾、疏肝解郁之功效，是疏肝解郁的代表方剂[1]。实验研究与临床应用均证实逍遥散抗抑郁作用确切。课题组前期采用“功效拆方”研究模式将逍遥散拆分为疏肝药(柴胡+薄荷)、养血药(当归+白芍)、疏肝药+健脾药(白术+茯苓+生姜+炙甘草)、养血药+健脾药药队组别，发现逍遥散疏肝药队、养血药队能明显改善CUMS模型大鼠抑郁样行为，认为柴胡、当归、白芍及薄荷是逍遥散全方发挥抗抑郁作用的主要功效药队[2]；在“功效拆方”研究基础上，通过小鼠FST、TST实验进行4味药物最佳配伍比例筛选，获得由柴胡、当归、薄荷3味药物组成的精简有效药队（逍遥散拆方药队），具有与全方相当的抗抑郁作用表现[3]。本研究以慢性不可预知温和应激（CUMS）大鼠模型为载体，基于前期药效学的研究基础，即该药队能有效改善CUMS大鼠的抑郁样行为，明显提高大鼠血清与脑组织中脑源性神经生长因子（BDNF）水平，降低ACTH、Cort浓度[4]，着重采用分子生物学方法测定CUMS大鼠皮层、海马部位BDNF通路相关分子的基因与蛋白表达水平，有效证实其抗抑郁作用发挥与干预BDNF通路的关系。

1 材料

1.1 实验药物

逍遥散全方与逍遥散拆方药队中当归、白芍、茯苓、白术、生姜、薄荷、炙甘草购自成都太极大药房；柴胡购自河北一仁药业有限公司。各组药物的制备方法与前期研究一致[4]。逍遥散全方药液浓度为1.5 g生药/mL，逍遥散拆方药队药液浓度为0.765、0.575 g生药/mL。实验中逍遥散剂量沿用前期研究有效剂量30 g．kg-1（临床剂量的30倍），逍遥散拆方药队依据前期研究中小鼠的有效剂量换算为大鼠的等效剂量，分别为15.33、11.5 g．kg-1。盐酸阿米替林（amitriptyline hydrochloride，10 mg．kg-1），SIGMA公司，批号039K1600。

1.2 实验动物

Wistar大鼠，SPF级，雄性，成都达硕生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（川）2015-030。

1.3 实验主要仪器

ZHWY-100H恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；MDF-U50V超低温冰箱，日本 Sanyo 公司；SYNS00000纯水仪，Millipore公司；UPT-2-5T超纯水仪，成都优普电子产品有限公司； DYY-6C电泳仪电源，北京市六一仪器厂；GELDOCEQ凝胶成像分析仪、iCycler iOMulticolor Real-Time PCR Dectection System、垂直式电泳仪、湿转转膜仪、Bio-Rad 小型垂直电泳槽、转膜槽、Bio-Rad ChemiDoc XRS+化学发光成像系统、Image Lab凝胶分析系统，美国Bio-Rad公司。

1.4 实验主要试剂

DEPC，AMRESCO公司，批号0855C144。AxyPrepTMMultisoure Total RNA Miniprep Kit 50-prep Nucleic Acid Purification Kit，AxyGEN公司，批号03415KD1。FastQuant RT Kit 100rxn(With gDNase)、SuperReal PreMixPlus20 μL*500 rxn (SYBR Green)，TIANGEN公司，批号分别为P4318、 P4229。RIPA裂解液（强）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、蛋白上样缓冲液（SDS-PAGE）5×，碧云天生物技术研究所，批号分别是P0013B、P0010S、P0015L。β-Tubulin Rabbit mAb、 TrkB Rabbit mAb、CREB Rabbit mAb、 pCREB Rabbit mAb、Anti-rabbit IgG HRP-Linked Antibody，Cell Signaling公司，批号分别为#2128、#4603、#9197、#9198、#7074。BDNF Rabbit mAb，abcam公司，批号ab108319。

2 实验方法

2.1 造模、分组与给药

取健康雄性Wistar大鼠适应性饲养3天，按体重分层随机分为6组：空白对照组及模型1-5组，模型组大鼠单只单笼饲养，并施加CUMS程序进行造模，空白对照组大鼠合笼饲养不施加造模程序。造模前及开始造模后每周测定大鼠糖水偏好率，造模4周后，通过比较模型组大鼠造模前后糖水偏好率的变化差异，且出现自主活动减少行为，以评价大鼠模型是否成功。第5周将筛选合格的模型1-5组大鼠重新分为CUMS模型对照组、阿米替林组（10 mg．kg-1）、逍遥散全方组（30 g．kg-1）、逍遥散拆方药队15.33、11.5 g．kg-1剂量组，各组动物开始分别灌胃给予相应药物，给药体积2 mL/100g，每日一次，连续4周，空白对照组与模型对照组大鼠给予等体积蒸馏水，给药期间模型组和所有药物组大鼠持续造模[4]。CUMS程序刺激因子参见文献选择[2]。

2.2 实时荧光定量PCR检测CUMS大鼠海马、皮层BDNF、TrkB、CREB mRNA表达水平

各组大鼠给药4周后进行行为学测试，测试结束后处死大鼠，迅速剥离大鼠全脑，在冰上分离取得大脑海马、皮层组织，-80℃保存备用。分别称取大鼠海马和皮层组织20～30 mg，置于冰上解冻，采用AxyGEN总RNA小量制备试剂盒提取样本总RNA，并检测RNA的纯度及含量，按照Quant cDNA 第一链合成试剂盒说明书进行逆转录获得cDNA，运用RT-PCR法检测BDNF、TrkB、CREB、GR mRNA的表达，各基因PCR反应程序如下：95 ℃ 15 min预变性；95℃ 10s变性及60.4℃（BDNF、TrkB）、62.4 ℃（β-actin、CREB）30s退火，39个循环；65℃ 5 s采集荧光，共60个循环，每循环温度增加0.5℃至95℃。采用相对定量法，以β-actin基因为内参基因，以样本的平均Cq值作为校正值。依据公式F=2-△△Cq=2-(△1Cq-△2Cq)，通过差异值反映逍遥散拆方药队对大鼠海马、皮层组织各指标mRNA表达的影响。所有引物由invitrogen(上海）公司设计合成，基因引物碱基序列见表1。

表1 基因引物序列

2.3Western Blot法检测CUMS大鼠皮层、海马BDNF、TrkB、CREB、pCREB蛋白表达水平

称取40 mg左右的大鼠海马或皮层组织，置于已灭菌烘干且用液氮预冷的的研钵中，加入液氮研成粉末状，再加入 400 μL RIPA 裂解液研磨，充分研磨融解后将匀浆液转移至1.5 mL EP管内，涡旋混匀，冰上放置直至充分裂解。4℃10000 g 离心 5 min，取上清，立即 用BCA 法测定样本总蛋白含量，将所有样本蛋白浓度调至等浓度。按WB法常规操作制备电泳样本，进行电泳后采用湿法转膜，转膜后的PVDF膜用封闭液封闭2 h，取出至新的封闭袋中，加入一抗（兔源Anti-β-Tubulin antibody、Anti-BDNF antibody、Anti-TrkB antibody、Anti-CREB antibody、Anti-pCREB antibody均按1:1000稀释），封口，4℃冰箱静置过夜。孵育后取出漂洗，再加入二抗（HRP-山羊抗兔IgG按 1：1000稀释）孵育1.5 h。取出PVDF膜漂洗后，显色液显色，ChemiDocTM XRS+Imaging System 凝胶扫描成像仪中扫描成像，运用Imade lab图像分析系统分析条带光密度值，采用目的蛋白与内参蛋白β-Tubulin条带光密度值的比值作为目的蛋白的蛋白相对表达量进行统计。

2. 4 数据统计

实验所得数据均以x±s表示，均用SPSS统计软件进行分析。计量资料符合正态分布，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），不符合正态分布者采用非参数秩和检验（Mann-Whitney U）分析。

3 实验结果

3.1 CUMS大鼠海马、皮层部位BDNF、TrkB、CREB mRNA的相对表达量

结果见表1、表2。与空白组比较，CUMS造模能显著降低大鼠海马、皮层BDNF、TrkB、CREB mRNA表达水平（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，逍遥散、逍遥散拆方药队11.5、15.33 g．kg-1剂量均明显上调海马部位BDNF、TrkB、CREB mRNA的表达水平（P＜0.05或P＜0.01）。逍遥散对皮层部位TrkB mRNA的表达有上调作用（P＜0.05）；逍遥散拆方药队15.33 g．kg-1剂量能显著上调皮层部位BDNF、TrkB、CREB mRNA的表达水平（P＜0.01），逍遥散拆方药队11.5 g．kg-1剂量呈现一定上调趋势（P＞0.05）。

表1 逍遥散拆方药队对CUMS大鼠海马BDNF、TrkB、CREB mRNA水平的影响（x±s）

表2 逍遥散拆方药队对CUMS大鼠皮层BDNF、TrkB、CREB mRNA水平的影响（x±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

3.2 CUMS大鼠海马、皮层部位BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表达水平

结果见表3、表4，图1。与空白组相比，CUMS程序造模能抑制大鼠海马、皮层部位BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白的表达，降低CREB磷酸化水平（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，在海马部位，逍遥散、逍遥散拆方药队11.5、15.33 g．kg-1剂量均明显促进BDNF、TrkB蛋白的表达（P＜0.05或P＜0.01）；逍遥散拆方药队11.5 g．kg-1剂量能提高CREB磷酸化水平（P＜0.01），逍遥散、逍遥散拆方药队15.33 g．kg-1剂量对CREB磷酸化有一定促进作用。在皮层部位，逍遥散明显促进CREB的磷酸化（P＜0.01），对BDNF、TrkB蛋白的表达有提高趋势；逍遥散拆方药队11.5 g．kg-1剂量明显提高TrkB蛋白表达和CREB磷酸化水平（P＜0.05或P＜0.01），对BDNF蛋白表达的作用不明显；逍遥散拆方药队15.33 g．kg-1剂量仅能显著提高CREB的磷酸化水平（P＜0.05），一定程度上调BDNF、TrkB蛋白表达。

表3 逍遥散拆方药队对CUMS大鼠海马BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表达的影响（x±s）

表4 逍遥散拆方药队对CUMS大鼠皮层BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表达的影响（x±s）

图1 CUMS大鼠海马、皮质部位BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表达图谱

4 讨论

脑源性神经营养因子（BDNF）是脑内最丰富的一种神经营养蛋白，BDNF 对神经元的生长、增殖、存活和突触活动至关重要[5]，在大脑皮层、海马、嗅 球、基底前脑、中脑、下丘脑各个区域均能检测到 BDNF 蛋白和 mRNA的表达[6]。BDNF 可通过促进神经突触生长而建立神经元和靶细胞之间的突触联系[7]，且能与其他主要神经递质系统（包括谷氨酸能神经系统、γ-氨基丁酸能神经系统、血清素能神经系统和多巴胺能神经系统）相互作用而参与促进正常神经系 统的发育[8～9]，研究发现，抑郁症自杀患者的海马和前额叶皮层部位的 BDNF 水 平降低，但在接受抗抑郁药物治疗的受试者中未观察到类似的 BDNF 降低现象[10]。此外，CUMS应激程序可引起动物海马和前额叶皮层 BDNF mRNA和蛋白 表达明显减少，抗抑郁药物的治疗则可增加这些大脑区域的 BDNF水平[11]，目前认为 BDNF的减少是抑郁症的发病机制之一。

BDNF 作为中枢神经级联信号传递的关键分子，与抑郁症的发生密切相关，是抗抑郁药物治疗的重要靶位，其功能的表达需要酪氨酸蛋白激酶 B（TrkB）参与。TrkB是受体酪氨酸激酶 Trk 家族的一员，为 BDNF 的特异性高亲和力受体，能介导BDNF下游通路[12]。文献报道抑郁样模型动物及抑郁症患者海马 BDNF 及其受体 TrkB 的水平明显降低，该表现可被抗抑郁药逆转[9,13]。BDNF 与 TrkB 结合致TrkB 酪氨酸残基的自磷酸化，随后通过 Ras-MEKMAPKERK1/2 或 PI3K-Akt 信号级联激活环磷腺苷反应元件结合蛋白（CREB），促进 CREB 磷酸化[14]。CREB是脑内重要的核转录因子，调节基因的表达，参与许 多与神经保护相关的过程，活化的 CREB 能够调控多种与神经细胞再生、存活 密切相关的活性物质的转录水平，包括 BDNF。抑郁患者的尸检发现，病人脑 内不仅 BDNF 和其受体 TrkB mRNA 表达水平，而且 CREB、pERK1/2 和 ERK1/2 的 mRNA水平均明显降低[15]，相反患者若经过抗抑郁治疗后上述基因表达水平有所提高[16]。抑郁症动物模型的研究亦表明，模型大鼠海马区 BDNF 表达明显下调，与 CREB 和 ERK1/2 的磷酸化水平降低有关[17]。

本实验表明，与空白组相比，CUMS 大鼠海马与皮层部位 BDNF、TrkB、 CREB mRNA 和蛋白表达水平，以及 CREB 磷酸化程度均下调，与该模型大鼠 前期研究发现的大鼠血清、海马与皮层部位 BDNF 水平，以及血清 TrkB、 CREB 水平均明显降低的结果相吻合[4]，且与已有的抑郁样动物和临床抑郁症患者研究的文献报道相符，进一步证实了 BDNF 在抑郁症发病机制与治疗中的重 要地位，同时也提示本研究中模型动物的成功建立。与模型组比较，逍遥散、 逍遥散拆方药队 11.5、15.33 g．kg-1剂量连续给药 4 周，均可提高 CUMS 大鼠中枢 BDNF、TrkB、CREB mRNA 和蛋白表达水平，并促进 CREB 磷酸化，其中在海马部位的上调作用相对优于皮质部位，逍遥散、逍遥散拆方药队作用表现 基本一致；其次该实验结果与前期直接测定CUMS 大鼠血清与中枢部位 BDNF、 TrkB、CREB水平的结果吻合[4]，从分子水平上表明了逍遥散拆方药队及逍遥

散全方能通过上调 BDNF-TrkB-CREB 通路发挥抗抑郁作用，且提示逍遥散精简药方即逍遥散拆方药队的作用机制与表现类似全方，具有较好的应用价值，同时再次证实了 BDNF是逍遥散及其拆方药队抗抑郁作用发挥的重要靶点，但究 其如何影响Ras-MEK-MAPK-ERK1/2 或 PI3K-Akt 信号通路来促进 CREB 的磷 酸化尚待进一步探讨。