以标准煎剂为基准建立夏枯草配方颗粒特征图谱的方法

农新维，杨梅，黄雄梅，邓慧连，王婵，周坚

中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成的中药颗粒剂。随着《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的公布，配方颗粒的标准研究有了明确规定，标准汤剂作为衡量配方颗粒的标准参照物，配方颗粒药效物质应与中药饮片水煎汤剂保持基本一致。因此，与标准汤剂作比对研究，成为了中药配方颗粒标准制定的重要前提。夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的干燥果穗，具有清肝泻火，明目，散结消肿的功效[1]。目前夏枯草报道主要集中在药材和配方颗粒[2-8]的单独研究，但其饮片、标准汤剂、配方颗粒的相关性研究尚未见报道。本实验建立了夏枯草饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱，对其相关性进行评价，为夏枯草配方颗粒质量标准的建立提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱系统（美国安捷伦公司），XPE205DR电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

迷迭香酸（批号111871-201102，纯度99.8%）、咖啡酸（批号110885-200102，纯度100%）、原儿茶醛（110810-200205，纯度100%）均购于中国食品药品检定研究院；丹参素（批号MUST-18060920，纯度98.38%）购于成都曼思特生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。15批夏枯草饮片、4批夏枯草配方颗粒由培力（南宁）药业有限公司提供；15批夏枯草标准汤剂按照《医疗机构中药煎药室管理规范》相关要求制备，编号及药材具体来源见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MGII（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A；10～22 min，10%→22%A；22～37 min，22%A；37～62 min，22%→38%A；62～65 min，38%→90%A；65～70 min，90%A）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长为280 nm，进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液…精密称取迷迭香酸、咖啡酸、原儿茶醛、丹参素对照品适量，用50%乙醇制成浓度分别为87.36，11.55，17.78，79.30 μg · mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 饮片供试品溶液…取夏枯草饮片粉末（过二号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25 mL，称重，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 标准汤剂供试品溶液…称取夏枯草饮片100 g，加18倍水浸泡30分钟，武火煮沸后改文火煎煮20分钟，滤过；加16倍水煎煮25分钟，滤过，合并2次水煎液，于50 ℃以下减压浓缩，真空冷冻干燥制得冻干膏粉。取该冻干膏粉适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称重，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 配方颗粒供试品溶液…取夏枯草配方颗粒适量，研细。称取细粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，称重，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.5 配方颗粒阴性对照溶液的制备…取按处方比例及制备工艺制得的不含夏枯草的阴性对照样品，按“2.2.4”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性及专属性实验…分别精密吸取混合对照品、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，进样分析，见图1。结果表明，样品中各个峰分离较好，峰形对称，且阴性无干扰，该方法专属性良好。

图1 夏枯草配方颗粒HPLC特征图谱

2.3.2 精密度实验…取同一份配方颗粒供试品溶液，进样10 μL，连续进样6次，以4号峰为S峰，计算1～5号特征峰与S峰的相对保留时间，结果各特征峰相对保留时间的RSD为0.20%～0.25%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性实验…取同一份配方颗粒供试品溶液，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，以4号峰为S峰，计算1～5号特征峰与S峰的相对保留时间，结果各特征峰相对保留时间的RSD为0.10%～0.23%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 重复性实验…按“2.2.4”项下方法制备6份配方颗粒供试品溶液，按拟定方法测定，以4号峰为S峰，计算1～5号特征峰与S峰的相对保留时间，结果各特征峰相对保留时间的RSD为0.11%～0.30%，表明方法重复性较好。

2.3.5 耐用性实验…取夏枯草配方颗粒供试品溶液，在原色谱条件基础上，采用不同检测柱温（30±5）℃、流速（1.0±0.1）mL·min-1测定同一供试品溶液，考察色谱条件的耐用性。以4号峰为S峰，计算1～5号特征峰与S峰的相对保留时间，结果在不同柱温、流速下，各特征峰相对保留时间的RSD分别为0.19%～2.71%、0.61%～2.74%，表明方法柱温及流速耐用性较好。

2.4 特征图谱的建立

按照拟定方法分别对15批夏枯草饮片、标准汤剂、4批配方颗粒进行测定，并建立了HPLC特征图谱，见图2～5。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行Mark峰匹配。共选择了5个重复性较好的峰作为共有特征峰。由图1可知，通过与对照品色谱图比较，峰1为丹参素，峰2为原儿茶醛，峰3为咖啡酸，峰4为迷迭香酸。以4号峰为S峰，计算1～5号特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，见表2。

图2 15批夏枯草饮片HPLC特征图谱及其对照指纹谱

图3 15批夏枯草标准汤剂HPLC特征图谱及其对照指纹谱

图4 4批夏枯草配方颗粒HPLC特征图谱及其对照指纹谱

图5 夏枯草饮片、标准汤剂和配方颗粒HPLC特征图谱比较

表2 各对照特征图的谱相对保留时间和相对峰面积

标准汤剂 0.318 0.175 0.693 1.000 0.250配方颗粒 0.297 0.183 0.465 1.000 0.210

2.5 饮片、标准汤剂、配方颗粒相关性研究

由图2～5、表2的结果分析，饮片、标准汤剂与配方颗粒均呈现1～5号共有特征峰，各特征峰相对保留时间稳定，相对峰面积较为接近，且三者相似度在0.987～0.996，说明饮片、标准汤剂与配方颗粒具有良好的相关性，配方颗粒与标准汤剂在化学成分上具有一致性，可为中药配方颗粒替代传统汤剂的可行性提供了重要依据。

3 讨论

3.1 实验条件选择

通过对供试品的190～400 nm全波长扫描显示，在280 nm处色谱峰数量较多，信息丰富，且峰形及分离度良好，选择了280 nm作为检测波长。分别采用了水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇对配方颗粒进行超声提取，结果50%乙醇峰形较好，响应值较高，故选择50%乙醇溶液作为提取溶剂。

3.2 特征峰指认

本实验对5号特征峰进一步研究，经质谱解析和文献查阅，鉴定为荆芥素A（schizotenuin A），因未能购到对照品，不能进行对照品定位，故未将峰5进行成分归属。

3.3 相关性分析

建立了夏枯草配方颗粒的 HPLC 指纹图谱，方法简单、快捷，夏枯草饮片-标准汤剂-配方颗粒特征图谱相似度高、化学成分基本一致，具有可追溯性，可全面对夏枯草配方颗粒生产过程中各环节进行质量控制，为其质量控制提供了有效手段及依据。