采用PCR-RFLP法鉴别IBDV强毒BC6／85株和弱毒B87株

陈仕怡，陈 媛，赖隆永，李春燕，刘梦茜，袁晓琴，郑庆礼，许丽惠，王全溪

(福建农林大学动物科学学院，福建福州350002)

传染性法氏囊病是由双股核糖核酸病毒家族的传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的具有免疫抑制性和高度接触性传染病[1]；IBDV强毒株会引发机体出现严重的损伤和病变，疫苗株则造成可逆性损伤[2].因此，准确鉴别强毒株和弱毒株对于制定IBDV的防治策略有着重要意义.目前，检测IBDV的方法主要有实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验、免疫组织化学和环介导等温扩增技术等，但这些方法大多无法有效地区分不同毒力株的病毒[3-6].限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-restrition fragment length polymorphism，PCR-RFLP)是在PCR和DNA序列分析的基础上产生的RFLP技术.DNA片段经PCR扩增后，选择适当的限制性内切酶消化，可得到特异性电泳图谱[7].

IBDV结构蛋白VP2是病毒粒子衣壳结构的主要成分，该蛋白为IBDV抗原集中区，可诱导细胞凋亡，具有决定病毒毒力及抗原变异等重要作用；同时，VP2基因具有高变区，极易突变，也参与决定了IBDV的繁殖力和繁殖速度[8-10].通过建立IBDV强、弱毒株的PCR-RFLP鉴别诊断方法，可为临床实践中IBDV强、弱毒株的快速鉴别诊断和流行病学调查提供一种便捷的方法，也可为IBDV的预防与治疗提供依据.

利用PCR-RFLP检测IBDV的方法较多，目前国内多采用SspⅠ作为鉴别vvIBDV的内切酶[5].杨蒙等[11]选取AhaⅠ、StuⅠ和BamHⅠ、NspⅠ两组限制性内切酶进行试验，发现其能够分别对超强毒株、强毒株和疫苗株进行酶切鉴定.本试验根据IBDVVP2基因保守区设计一对通用引物和两个限制性内切酶位点(BamHⅠ和PstⅠ)，采用PCR-RFLP分析酶切产物，可以准确性、高效率鉴别诊断IBDV强毒株和弱毒株.研究结果可为快速鉴别IBDV强、弱毒株提供可靠的方法.

1 材料与方法

1.1 材料

IBDV弱毒B87株、IBDV强毒BC6/85株及传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)、鸡新城疫病毒(newcastle disease，ND)、鸡淋巴细胞性白血病(lymphoid leukosis virus，LLV)、禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV)、禽4型腺病毒(fowl adenovirus serotype-4，FAdV-4)、腺病毒的标准阳性核酸，由福州某生物技术有限公司提供.

病毒RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，PCR试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 参考GenBank中IBDV B87株和BC6/85株的VP2共保守区段，通过基因序列分析软件及引物设计分析软件DNAman 6.0、Primer Premier 5.0设计引物(上游引物：5′-AGGAAGCCTGAGTGAACTGACA-3′；下游引物：5′-TGGCATCAAGACCGTCTGGCC-3′)，预计目的片段的长度为 856 bp.1.2.2 病毒RNA的提取 按照病毒RNA提取试剂盒操作步骤提取病毒RNA，置-80℃下保存或立即反转录成cDNA.

1.2.3 PCR扩增与鉴定 按照常规反转录体系和反应条件在20 μL体系中进行反转录.反转录体系和反应条件为：2 μL RNA 模板、4 μL 5×反应缓冲液、2 μL 25 mmol·L-1氯化镁、1 μL 随机引物、1 μL 寡聚胸腺嘧啶引物、1 μL 10 mmol·L-1PCR核苷酸混合液、1 μL逆转录酶、0.5 μL核糖核酸酶抑制剂，用无核酸酶水补足至20 μL，于42℃孵育15 min，72℃加热15 min.根据常规PCR反应体系(50 μL)将反转录所得的产物再用上、下游引物进行 PCR扩增.PCR扩增体系为：2 μL cDNA模板，上、下游引物各2 μL，25 μL 2×PCR预试剂(含染料)，加无核酸酶水补足至50 μL.反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃扩增30 s，这3个步骤循环35次，最后于72℃延伸10 min，于4℃结束反应.取扩增完成的PCR产物30 μL，用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的基因片段的大小，与标准的DNA分子量标准物，如DL2000 Marker或Trans2K Plus DNA Marker进行比较，以查看是否扩增出856 bp的特异性片段，与预计的目的片段是否相一致.

1.2.4 目的基因的回收与测序 按照琼脂糖凝胶回收试剂盒的要求回收目的基因，取10 μL送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，与GeneBank上的基因序列进行比对.

1.2.5 酶切鉴定 取“1.2.4”中回收的目的基因，用BamHⅠ和PstⅠ酶切，反应体系和反应条件为：20 μL纯化的 PCR 目的片段(≤0.4 μg)、6 μL 10×快切酶缓冲液、1 μL 快切酶BamHⅠ、1 μL 快切酶PstⅠ，用无核酸酶水补足至60 μL，于30℃孵育30 min，再加入PstⅠ孵育2 h.用2%琼脂糖凝胶电泳(95 V、27 min)鉴定酶切片段的大小.

1.2.6 特异性检测 按“1.2.3”、“1.2.4”和“1.2.5”的方法检测正常的鸡组织、IBV、IBDV、ND、LLV、ARV和FAdV-4.

1.2.7 敏感性检测 取IBDV BC6/85株RNA作10的倍比稀释成2 000、200、20、2、0.2和0.02 pg，各取1 μL分别按“1.2.3”、“1.2.4”和“1.2.5”的方法进行PCR扩增与鉴定，观察结果，确定其最低的检测量.

1.2.8 重复性检测 按“1.2.3”、“1.2.4”和“1.2.5”的方法分别对IBDV BC6/85株和B87株阳性样本的目的基因进行酶切，重复3次.

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

分别提取IBDV BC6/85株和B87株的RNA，反转录后进行PCR扩增，均得到大小为856 bp的目的基因条带(图1)，与预计期望得到的扩增目的基因条带片段的大小相一致.

2.2 PCR产物测序结果及酶切位点

将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并进行酶切位点分析.结果表明，BC6/85株的目的片段具有BamHⅠ和PstⅠ限制性内切酶位点，而B87株的目的片段仅有一个PstⅠ限制性内切酶位点(图2、图3).

图1 IBDV BC6／85株和B87株VP2基因的RT-PCR扩增产物Fig.1 RT-PCR amplification products of VP2 gene for IBDV BC6/85 and B87

图2 IBDV BC6／85株目的片段的酶切位点Fig.2 Restriction site of the target fragment in BC6/85 strain

图3 IBDV B87株目的片段的酶切位点Fig.3 Restriction site of the target fragment in B87 strain

2.3 酶切鉴定结果

PCR产物经DNA回收试剂盒回收目的基因，用BamHⅠ和PstⅠ双酶切后，IBDV BC6/85株被切出166、242和449 bp大小的3条目的条带(图4)，而B87株仅能被PstⅠ切出242和615 bp大小的2条片段(图5).

图4 IBDV BC6／85株RT-PCR产物的BamHⅠ、PstⅠ酶切图谱Fig.4 Restriction map of IBDV BC6/85 cut by BamHⅠand PstⅠ

图5 IBDV B87株RT-PCR产物的BamHⅠ、PstⅠ酶切图谱Fig.5 Restriction map of IBDV B87 cut by BamHⅠ and PstⅠ

2.4 特异性检测结果

抽提正常鸡组织、IBV、NDV、LLV、ARV、FAdV-4及IBDV BC6/85株、B87株的mRNA进行PCR-RFLP扩增.结果表明，只有IBDV BC6/85株和B87株的PCR扩增结果出现856 bp大小的片段，其他6个样品没有出现目的片段(图6)；同时，只有IBDV BC6/85株和B87株的酶切结果出现相应的酶切图谱(图7).可见，本试验建立的鉴别方法具有较好的特异性.

图6 PCR特异性检测结果Fig.6 Specificity of PCR

图7 酶切特异性检测结果Fig.7 Specificity of enzyme digestion

2.5 敏感性检测结果

分别取 1 μL 2 000、200、20、2、0.2 和 0.02 pg BC6/85株的 cDNA进行 PCR扩增，只有 0.02 pg BC6/85株的cDNA进行PCR扩增后不出现目的片段，其他5个均能扩增出相应的目的条带，表明该方法可以检测到0.2 pg的核酸(图8).

2.6 重复性检测结果

分别选取3份相同的IBDV BC6/85株和B87株cDNA进行PCR-RFLP，BC6/85株3份样品均在166、242和449 bp处得到清晰可见、与目的条带一致的片段(图9)；B87株3份样品均在242和615 bp处得到与目的条带一致的片段(图10).

图8 酶切敏感性检测结果Fig.8 Sensibility of enzyme digestion

图9 IBDV BC6／85株PCR重复性检测结果Fig.9 Repeatability of PCR for IBDV BC6/85

图10 IBDV B87株PCR重复性检测结果Fig.10 Repeatability of PCR for IBDV B87

3 讨论

刘玉锋[12]研究表明：不同毒力的IBDV毒株致死率不同，感染后3 d，BC6/85株感染组鸡群出现严重的临床症状和免疫器官病变，而B87株接种组则未表现出临床症状，非免疫器官也并无损伤；而免疫器官仅在感染后3 d出现轻度损伤，且巨噬细胞也出现了增加的现象.因此，准确鉴别强毒株和弱毒株对于制定IBDV的防治策略有着重要意义.

PCR-RFLP在禽类病毒鉴别诊断中的应用十分广泛.唐熠等[13]等采用PCR-RFLP提取病畜血清鉴别Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型，该方法具有快速、低成本的优势，提高了腺相关病毒的临床诊断和防治效率.本试验先通过PCR扩增目的DNA，之后利用限制性内切酶进行酶切鉴定，提高了目的DNA的含量及相对特异性、灵敏度，同时降低了IBDV的检测成本.

利用本试验设计并合成的特异性引物，对两种IBDV毒株的RNA进行RT-PCR扩增，能检测出一条PCR特异性条带，扩增出的DNA目的片段大小为856 bp，与试验设计时预期的目的片段一致.选取BamHⅠ和PstⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定，发现其能够对超强毒株BC6/85和弱毒株B87进行酶切，获得两种结果.可见，本试验采用的这种RT-PCR-RFLP方法能够较好地区分两种毒株，该法特异性强且试验时间短，为IBDV强毒株和弱毒株的快速鉴别诊断及流行病学调查提供一种新的有效方法，同时为疫苗研发过程中对疫苗株的验证和鉴定提供新思路，为IBDV的预防与治疗提供参考.